目的:烟曲霉是一种重要的丝状病原真菌,是导致真菌性肺炎最主要的病原真菌之一,其致病力主要是由于其特异性的毒力因子决定。DHN-黑色素是烟曲霉中一个重要的毒力因子,被合成以后释放到细胞外面(分生孢子)形成多聚的黑色素层。动物实验表明黑色素是决定毒力大小最重要的毒力因子,如果敲除与DHN-黑色素合成相关的基因,破坏黑色素的合成或者最终产物的形成,其感染动物的能力就变得非常微弱。因此,对于黑色素合成的过程以及黑色素合酶的基因调控和细胞空间定位,对于研究烟曲霉的致病性管控和寻找药物靶点非常重要。因为黑色素的合成在细胞内以游离状态合成还是―封闭‖的小型空间完成的并不清楚,故本论文将从黑色素合酶的细胞定位方面展开研究,以探索黑色素合成的细胞定位。早期的实验数据和文献表明,黑色素合酶的细胞空间定位是在―封闭‖的细胞颗粒中,这些颗粒与早期溶酶体标记蛋白Rab5相关,表明这些黑色素合酶是定位到细胞早期溶酶体中并完成黑色素的早期合成。对于具备―典型‖细胞质蛋白特点的黑色素合酶,是如何被识别和分拣到早期溶酶体中进行定位的机制尚不清楚。在本论文中将探索具体的黑色素合酶的分拣机制。方法:首先通过荧光蛋白标记黑色素合酶,观察到黑色素合酶是定位在早期溶酶体中,且与早期溶酶体标志蛋白Rab5共定位。其次我们采用免疫共沉淀的方法寻找与合酶相互作用的蛋白,主要通过标记黑色素的早期合酶(FLAG/GFP标记),进行下一步的亲和层析,获得与标记合酶相互作用的蛋白,用液质联用(LC-MS/MS)鉴定出相互作用的蛋白,分析其中可能参与蛋白质修饰、分拣、定位和运输相关的蛋白,通过基因敲除验证这些蛋白是否真正参与黑色素合酶的细胞定位以及影响黑色素的最终合成。最后通过前期工作,我们知道蛋白质棕榈酰化是蛋白质定位的一个重要的机制。我们想知道黑色素合酶是否与棕榈酰化转移酶相互作用,是否被棕榈酰化。因此我们将会应用棕榈酰化蛋白质纯化提取棕榈酰蛋白并结合液质联用(LC-MS/MS)的方法鉴定烟曲霉中被棕榈酰化的蛋白质。最后通过生物信息学分析蛋白组所鉴定出的蛋白功能,进行功能验证。通过抑制棕榈酰转移酶的活性,观察黑色素合酶的细胞定位以及黑色素合成是否受到影响。在将来的实验进一步验证,我们通过基因敲除和超表达再进行表型观察和测定是验证基因功能的直接方法。而对于棕榈酰修饰对黑色素合酶细胞定位的影响将从两方面来验证,一是通过棕榈酰修饰位点分析和测定后进行定点突变,使得修饰不能完成,从而来验证黑色素合酶的功能和细胞定位;另外就是直接敲除棕榈酰转移酶后,验证黑色素合酶是否还能正常细胞定位和完成黑色素的合成。结果:根据DHN-黑色素合酶的亚细胞定位,我们可以推断出来黑色素是在分泌性颗粒中(早期内涵体)中完成前期合成,随后通过内涵体被分泌到细胞表面,由定位在细胞表面的晚期合酶(Abr1/Abr2)完成进一步的催化和多聚从而形成最终的黑色素,并分布在细胞表面。黑色素在分泌性颗粒中完成初始合成,早期合酶Alb1/Ayg1/Arp1/Arp2共定位在分泌性内涵体中,能够高效率地在颗粒小泡内完成合成黑色素的前体,随后这个前体通过胞吐(Exocytosis)被分泌到细胞表面。在本论文中,我们进一步证实了早期合酶的亚细胞定位——溶酶体中,晚期合酶定位在细胞上;另外,我们初步纯化和质谱鉴定了分生孢子阶段时期的棕榈酰蛋白组,质谱检测结果证实4个黑色素早期合酶都在蛋白组中被鉴定出来,进一步用蛋白质印迹分析(Western Blotting)证实在棕榈酰化蛋白组中检测到黑色素早期合酶。抑制棕榈酰转移酶的活性或者棕榈酰化修饰的发生,可以通过抑制黑色素合酶被棕榈酰化从而干扰黑色素合酶的正确定位。结论:早期合酶是定位在内涵体上完成黑色素的前期合成,随后被分泌到细胞表面,被定位在细胞壁上的黑色素晚期合酶进一步催化和多聚形成最终的黑色素。如果Mvp1蛋白缺失,定位在内涵体上的早期合酶的回收利用被阻断,从而无法使得新合成的黑色素中间体被内涵体通过胞吐运输到细胞表面。通过生物信息学分析和细胞定位预测可知,黑色素早期合酶是个典型的―细胞质‖蛋白。这个细胞质蛋白是如何被识别和分拣到内涵体中的,我们初步实验已证实,棕榈酰化修饰是一个非常重要的步骤,如果抑制棕榈酰转移酶的活性,则黑色素早期合酶的在内涵体的定位会被阻止。