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背景及目的 芬太尼为阿片类镇痛药物,镇痛作用好,是吗啡镇痛作用的50-100倍,广泛应用于临床麻醉以及癌症病人的镇痛治疗中。临床工作中发现,不同患者使用同等剂量的芬太尼产生的镇痛效果和副作用明显不同。芬太尼主要通过肝脏中CYP3A4酶进行代谢成为几乎没有活性的去甲基芬太尼,研究发现,不同患者的CYP3A4酶活性差异性很大,而基因多态性是影响CYP3A4酶活性的主要因素[1,2]。近年来,人们研究发现一种小分子单链RNA(miRNA)可以作用于基因的转录后过程,影响蛋白的表达,在生命的发生发展过程中起着重要的作用[3,4]。肝脏组织中也发现了多种miRNA,但是这些miRNA有些是无功能的,有些是有功能的,需要进行相关实验进行验证。有研究指出Hsa-miR-660可能与CYP3A4酶活性存在相关性,但尚且没有进行细胞水平的验证[5]。本实验主要研究肝细胞中Hsa-miR-660相对表达量对CYP3A4蛋白表达的影响。材料与方法 所用的细胞为人正常肝细胞chang liver,将稳定表达的chang liver细胞培养于37°5%co2的培养箱内,培养基为含10%胎牛血清rpmi1640,2-3天换一次培养基,保证细胞可以正常生长。在细胞生长良好时可准备病毒转染。转染前将细胞铺于6孔板上,继续进行细胞培养,在细胞融合度达到80%以上时可进行转染。实验分为四组:分别为对照组(c)、mirna过表达组(h)、mirna沉默组(l)和阴性载体组(n)。c组加入等量的完全培养基,l组加入包裹抑制hsa-mir-660表达质粒的慢病毒,h组加入包裹过表达hsa-mir-660质粒的慢病毒,n组加入包裹空载体的慢病毒进行转染。转染时按moi=50加入病毒后共同培养,24小时后将含有病毒的培养基吸出,加入含有10%胎牛血清的完全培养基继续培养。48-72h后进行在荧光显微镜下观察转染效率。转染成功后一部分细胞提取总rna,实时荧光定量法进行测定cyp3a4mrna相对表达量和hsa-mir-660相对表达量。内参分别为gapdh和u6。剩余细胞继续培养,待细胞生长较为旺盛时提取总蛋白,westernblot法测定cyp3a4的相对表达量,内参为gapdh。结果1转染效率测定荧光显微镜下观察转染效率,h组、l组、n组三组转染效率均为50%-70%。2hsa-mir-660相对表达量的测定实时荧光定量pcr法测定四组hsa-mir-660相对表达量,f=31.857,p〈0.05,差异有统计学意义.n组与c组相比,差异没有统计学意义(p=0.564〉0.05).h组较c组hsa-mir-660表达量显著增加,l组较c组hsa-mir-660表达量显著降低。h组(8.372±0.403)较n组(4.847±0.511)hsa-mir-660表达量显著增加,l组(2.985±0.407)较n组(4.847±0.511)hsa-mir-660表达量显著降低,差异均有统计学意义。3cyp3a4mrna表达量的测定rt-pcr法测定四组cyp3a4mrna,四组mrna的表达量不存在差异,f=0.381,p=0.768>0.05。4cyp3a4蛋白表达量的测定westernblot法测定四组cyp3a4蛋白相对表达量,四组之间cyp3a4蛋白的相对表达量存在统计学差异,f=20.225,p〈0.01。c组和n组之间差异没有统计学意义(p〉0.05),h组较c组cyp3a4蛋白相对表达量显著降低,l组较c组cyp3a4蛋白相对表达量显著升高;h组(0.00548±0.00186)较n组(0.01768±0.04633)cyp3a4蛋白相对表达量显著降低,l组(0.04092±0.01112)较n组(0.01768±0.04633)cyp3a4蛋白相对表达量显著升高,差异均存在统计学意义(p〈0.01)。结论 1、Hsa-miR-660并不影响CYP3A4 m RNA的稳定性。2、细胞水平上Hsa-miR-660抑制了CYP3A4蛋白的表达。