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随着人类基因组计划的完成，我国已经从大规模的基因测序转向以细胞水平为主的功能研究、疾病相关性研究等前沿领域。自2002年起，我国将“功能基因组与生物芯片”列入12个国家重大科技专项，其中的第一个专题为“人类重大疾病相关基因的研究”，其中“人类重要生理活性及具有药物开发前景的功能基因的研究”的主要内容包括：建立规模化的人类重要生理功能基因克隆化鉴定；重组蛋白表达；细胞水平与动物整体水平的筛选；系统性的基因功能研究并最终进入基因组药物和药物靶标的开发阶段。
Ras同源蛋白相关的包含两个BTB结构域的基因2(rho-related BTBdomain-containing 2，Rhobtb2)属于Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶(SmallGTPascs of Rho family,Rho GTPases)，是Rho GTPases进化保守的Rhobtb亚家族的成员之一<[5,6]>。Rhobtb2基因定位于人类染色体8p21，基因组全长约20.5kbp，包含编码序列2184 bp，共有9个外显子。RhoBTB2蛋白在多种组织中均微量表达，其中神经组织的表达水平最高，它参与细胞周期的调控及细胞骨架蛋白的形成，与转录调控、信号转导等多种生命活动有关。近年来，国外有些研究发现该基因在多种肿瘤组织如乳腺癌、膀胱癌、肺癌中表达降低或缺失，从而引起研究人员的关注。目前有关该基因的功能研究在国内尚未开展。我们的课题研究将围绕着与乳腺癌、肺癌相关的肿瘤抑制基因Rhobtb2展开。
本研究首先采用Rt-PCR技术检测了Rhobtb2基因在正常胚胎组织及多种肿瘤细胞中的表达水平，初步探明Rhobtb2基因在肿瘤细胞中的表达状况，并运用DNA重组技术构建了Rhobtb2基因的真核表达载体，将野生型Rhobtb2基因转入表达缺失的乳腺癌细胞，为进一步研究其生物学功能及探讨将其用于基因治疗的可能性奠定基础。
研究目的：
检测Rhobtb2基因在正常胚胎组织及多种不同肿瘤细胞株中的表达情况，并参照GenBank中Rhobtb2的DNA序列调取目的基因，并构建真核表达载体。
实验方法：
1．细胞培养及组织保存：细胞株于培养液中，置于37℃、5％CO<,2>的孵箱常规培养。新鲜胎脑组织取小块，置于液氮罐中速冻，保存备用。
2．Rhobtb2基因表达水平检测：提取组织或细胞的total RNA，运用Rt-PCR法检测Rhobtb2基因在正常胚胎组织及多种不同肿瘤细胞株中的表达水平。
3．Rhobtb2目的基因的调取：采用Rt-PCR的方法，从人胚肺细胞中提取totalRNA后，PCR扩增Rhobtb2基因的CDS区域(2184bp)，并通过上下游引物添加合适的酶切位点。
4．Rhobtb2克隆载体的构建并测序：采用基因重组技术构建pMD19-Tsimple-Rhobtb2重组载体，采用PrimerWalking法进行目的基因的测序，并与GenBank上NM_015178 Rhobtb2的DNA序列比对。
5．目的基因的突变修复：根据测序结果，采用引物修复、重组PCR和酶切反应进行DNA的突变修复，采用基因重组技术将目的基因克隆到载体上进行测序，直至目的基因的测序结果与参考序列一致。
6．Rhobtb2表达载体的构建：采用基因工程技术构建pEGFP-N1-Rhobtb2重组表达载体。
7．将Rhobtb2重组表达载体导入T-47D细胞：运用阳离子脂质体转染的方法，选用LipofectAMINE 2000将重组表达载体转染入靶细胞，利用荧光显微镜、流式细胞仪技术检测不同条件的转染效率，从而对转染条件进行优化。
8．稳定转染的细胞系的筛选：采用G418最低致死量法加压筛选稳定转染的细胞系，通过MTT法测定G418的最低致死量。
实验结果：
1．Rhobtb2基因在乳腺导管癌细胞株T-47D中表达缺失，但在乳腺腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3及卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和胃癌细胞中均有表达。实验筛选出了Rhobtb2表达缺失的乳腺癌细胞系T-47D，这为下一步Rhobtb2基因的功能研究提供了良好的前期研究基础和理想的模板。
2．人胚肺细胞中调取了Rhobtb2的CDS区域，并通过引物在目的基因的上下游分别添加了EcoR1和BamH1两个酶切位点。
3．将pMD19-T simple vector与Rhobtb2重组后，经PCR及酶切鉴定，构建了pMD19-T simple-Rhobtb2重组载体，测序结果显示有三个碱基突变。
4．通过基因突变的修复，克隆测序结果与GenBank NM_015178即Rhobtb2的DNA参考序列一致。
5．将修复成功的Rhobtb2基因与pEGFP-N1真核表达载体重组后，经PCR及酶切鉴定，构建了重组表达载体，命名为pEGFP-N1-Rhobtb2。
6．将重组表达载体按照优化的转染条件导入T-47D细胞，经G418压力筛选获得稳定转染的细胞系。
结论：
本实验检测了Rhea2基因在正常胚胎组织细胞及多种不同肿瘤细胞株中的表达水平，并调取了Rhobtb2的CDS区域，成功构建了pEGFP-N1-Rhobtb2重组真核表达载体，建立了稳定转染Rhobtb2基因的细胞模型，为该基因的功能及疾病关联性研究奠定了基础。