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研究背景反复性流产是指孕20周前连续3次或3次以上的自然流产,在妊娠女性中发生率约为1%～2%。胚胎染色体异常一直被认为是反复性流产的主要因素。此外,父母染色体异常、内分泌异常、生殖道解剖异常、免疫因素、感染等其他病因也会导致反复性流产的发生。然而,仍然有至少50%反复性流产的原因尚不明确。绒毛外滋养细胞侵入母体内膜建立有效的母胎循环系统之间的生理交换,从而满足胎儿的营养需求,绒毛外滋养细胞侵袭力下降可能会导致流产的发生。生物节律是通过基因表达调控而实现的,并参与调节月经周期、排卵、胚胎着床以及妊娠的维持。日常生活中各种环境因素的干扰可能会导致月经不规律、血清中黄体生成素和卵泡刺激素水平的改变、早产,以及生育力下降。BMAL1(Brain and muscle ARNT-like protein 1)基因是哺乳动物生命活动昼夜节律振荡器中的关键元件。研究发现,在自然流产女性外周血中,BMAL1基因多态性明显增多。并且BMAL1与哺乳动物的卵泡发育、胚胎着床和雌孕激素合成均有密切的相关性,提示BMAL1在生殖系统中的重要作用,然而目前并没有研究探讨BMAL1在反复性流产中的作用。BMAL1在反复性流产患者绒毛组织中的表达与人工流产患者绒毛组织是否存在差异,人滋养细胞中BMAL1是否参与调节细胞的迁移和侵袭能力并不明确,相关分子机制非常少见。妊娠后孕酮主要使增生期子宫内膜转化为分泌期,为胚胎着床做准备。孕酮是维持妊娠、预防流产的重要激素,而孕酮对BMAL1所介导的信号通路是否存在调节作用尚不清楚。本课题旨在研究生物节律基因BMAL1与反复性流产的关系,并从分子机制及信号通路上探讨BMAL1对滋养细胞迁移和侵袭能力的具体调控作用。方法:1、人流产绒毛组织中BMAL1与反复性流产的相关性研究:我们收集了上海交通大学医学院附属仁济医院计划生育门诊就诊的38例散发性流产患者(1次或2次)、11例反复性流产患者(≥3次)及50例人工流产患者行负压吸引清宫术后残余绒毛组织。样本排除了父母染色体异常、生殖道畸形、内分泌异常、免疫功能异常、甲状腺功能异常、感染以及高血压、糖尿病、冠心病等慢性疾病,同时针对反复性流产患者进行绒毛染色体检查,排除绒毛染色体异常病例。检测记录了包括年龄、孕周、流产次数、染色体等临床指标。绒毛组织液氮研磨后,通过q RT-PCR和Western Blot分别检测目标基因BMAL1、SP1(Special protein1)、DNMT1(DNA 5′-cytosine-methyltransferases 1)和DAB2IP(DAB2 interaction protein)在mRNA水平和蛋白水平的表达差异。2、BMAL1对滋养细胞迁移侵袭能力的具体调控机制:利用人永生化绒毛外滋养细胞系HTR-8/Svneo作为细胞模型,通过划痕实验和Transwell实验检测BMAL1对滋养细胞迁移和侵袭能力的作用。然后应用HTR-8/Svneo细胞系和人绒毛膜细胞癌细胞系JEG-3作为细胞模型,采用干扰RNA、过表达等实验,通过q RT-PCR和Western Blot等方法研究BMAL1对滋养细胞迁移侵袭能力的具体调控机制。最后应用HTR-8/Svneo细胞系,添加不同浓度孕酮后,通过q RT-PCR和Western Blot等方法检测BMAL1及下游分子在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,研究孕酮对BMAL1所介导的信号通路是否存在调节作用。结果1、人流产绒毛组织中BMAL1与反复性流产的相关性研究:在mRNA水平和蛋白水平上,BMAL1、SP1、DMNT1、DAB2IP在散发性流产患者绒毛组织中的表达和在绒毛染色体正常的反复性流产患者绒毛组织中的表达,分别相较于在人工流产患者绒毛组织的表达均降低。2、BMAL1对滋养细胞迁移侵袭能力的具体调控机制:(1)HTR-8/Svneo细胞系中,分别敲低BMAL1、SP1、DMNT1、DAB2IP后,细胞迁移能力和侵袭能力均降低。(2)HTR-8/Svneo细胞系中,敲低DAB2IP后,MMP2、MMP9表达水平降低。敲低DNMT1后,MMP2、MMP9表达水平降低。敲低SP1或过表达SP1后,DNMT1、DAB2IP、MMP2、MMP9表达水平分别降低或升高。敲低BMAL1或过表达BMAL1后,DNMT1、DAB2IP、MMP2、MMP9表达水平分别降低或升高。(3)JEG-3细胞系中,敲低DAB2IP后,MMP2、MMP9表达水平降低。敲低DNMT1后,MMP2、MMP9表达水平降低。敲低SP1后,DNMT1、DAB2IP、MMP2、MMP9表达水平降低。敲低BMAL1后,DNMT1、DAB2IP、MMP2、MMP9表达水平无明显改变。(4)HTR-8/Svneo细胞系中,分别添加0、5、10、15μmmol/L孕酮处理24小时后,BMAL1、SP1、DMNT1、DAB2IP表达随着孕酮浓度的增大逐渐升高。敲低BMAL1后添加15μmmol/L孕酮,发现BMAL1、SP1、DMNT1、DAB2IP表达水平相较于未敲低BMAL1而添加孕酮组降低。15μmmol/L孕酮处理HTR-8/Svneo细胞系24小时后,MMP2和MMP9的表达降低。敲低BMAL1后添加15μmmol/L孕酮,发现MMP2和MMP9表达水平相较于未敲低BMAL1而添加孕酮组降低。过表达BMAL1后添加15μmmol/L孕酮,发现MMP2和MMP9表达水平相较于未过表达BMAL1而添加孕酮组升高。结论我们的研究阐述了BMAL1在人滋养细胞系中对细胞迁移和侵袭能力的调控作用,发现BMAL1通过SP1分别调节DNMT1和DAB2IP的表达,从而影响MMP2和MMP9的表达,最终使滋养细胞的迁移和侵袭能力发生改变。值得注意的是,BMAL1对下游分子的调节作用只发生于人永生化绒毛外滋养细胞系HTR-8/Svneo,而在人绒毛膜细胞癌细胞系JEG-3中未检测到。孕酮可以增强BMAL1介导的这一信号通路功能,但是可能存在其他信号通路导致较高浓度的孕酮最终对细胞侵袭代表分子MMP2和MMP9的表达呈负性调节。BMAL1及其下游分子在散发性流产患者绒毛组织及绒毛染色体正常的反复性流产患者绒毛组织中的表达下调,从生物节律角度为反复性流产,尤其是绒毛染色体核型正常的反复性流产的发病机制提供了新的理论基础,为流产预防治疗提供了新思路和新靶点。