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沙门氏菌是一类兼性且人畜共患的细胞内寄生的革兰氏阴性杆菌,能通过各种机制逃避宿主的吞噬和杀灭作用,在细胞内存活和传播,导致持续性感染和复发感染。大多数抗菌药物较难进入细胞,在细胞内浓度低,达不到清除细菌所需要的有效浓度,从而不能有效的治疗胞内沙门氏菌感染。恩诺沙星因抗沙门氏菌活性强且能有效的跨细胞扩散,被广泛用于预防和治疗胞内沙门氏菌感染,但其在胞内蓄积能力弱、不能在细胞内长时间维持有效浓度,导致临床治疗效果不理想。研究表明纳米能显著提高抗菌药物在胞内的浓度和停留时间,为解决恩诺沙星治疗沙门氏菌胞内感染面临的困难提供了新的策略。本课题采用不同脂肪酸作为脂质基质制备恩诺沙星固体脂质纳米(Solid lipid nanoparticles,SLN),通过比较脂肪酸、粒径和电荷对SLN包裹的恩诺沙星在RAW264.7细胞内摄取和蓄积的影响,筛选出可显著提高胞内恩诺沙星浓度和停留时间的SLN,并开展优化的恩诺沙星SLN抗胞内沙门氏菌感染以及经猪体内不同给药途径的药动学研究,为治疗胞内菌感染提供新的突破口。1.恩诺沙星-脂肪酸SLN的制备及其胞内传递性能研究本研究分别以肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和山嵛酸为脂质基质,以聚乙烯醇(PVA)为活性剂,采用热熔乳化超声法制备恩诺沙星-脂肪酸SLN,运用高效液相色谱法(HPLC)测定纳米的包封率和载药量;运用原子力显微镜(AFM)和马尔文激光纳米粒度仪测定脂肪酸SLN的形态、大小、多分散系数和电位;通过单因素对照试验确定最佳药脂比;通过考察不同脂肪酸制备的恩诺沙星SLN对RAW264.7细胞摄取和细胞蓄积的影响,筛选出可靶向于细胞内高效传递恩诺沙星的脂肪酸SLN。AFM显微镜观察恩诺沙星-(肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和山嵛酸)SLN呈均一的类球形分布,其包封率分别为65.26、67.53、72.57和86.56%;载药量分别为6.44、6.65、7.12和8.37%;粒径分别为 341.4、348.8、408.5 和 414.5nm;多分散系数分别为 0.241、0.264、0.352和0.265;电位分别为-19.9、-20.6、-21.3和-22.1mV。恩诺沙星在熔融脂肪酸中的饱和溶解度为1:9,因此最佳药脂比为1:9。细胞内摄取表明,在相同的胞外药物浓度和作用时间下,脂肪酸SLN包裹的恩诺沙星摄入RAW264.7细胞的量是游离恩诺沙星的4.34～37.71倍,其中,山嵛酸SLN包裹的恩诺沙星在0.5h达到最大胞内浓度0.8861μg/mg。研究发现山嵛酸SLN包裹的恩诺沙星在细胞内停留时间也最长,在移除细胞外药物后继续孵育2h,山嵛酸SLN包裹的恩诺沙星在细胞内的浓度为0.4031μg/mg,而游离的恩诺沙星和其它三种脂肪酸SLN包裹的恩诺沙星在细胞内检测不到。由此可见,恩诺沙星-山嵛酸SLN胞内传递性能最强,因此作为进一步优化的候选纳米。2.粒径和电荷对恩诺沙星-山嵛酸SLN胞内传递性能的影响在筛选出最佳脂肪酸后,进一步考察了粒径和电荷对山嵛酸SLN摄入RAW264.7细胞的影响。通过改变活性剂PVA的浓度(1、2、4%)和体积(10、20、30mL),以及向PVA中添加不同浓度(0.5、2、3和4%)的阳离子型活性剂二甲基双十八烷基氯化铵(DDAC),在细胞超声破碎仪探头为3、6和30mm,超声振幅为60%和80%,超声时间为8min的条件下,制备出605、415、150nm等不同粒径和-24.9、-17.5、-8.1、7.1、18.8mV等不同电荷的恩诺沙星-山嵛酸SLN。细胞内摄取表明胞内恩诺沙星的浓度随着粒径的增加而增强,150、415和605nm的恩诺沙星-山嵛酸SLN在细胞内的浓度分别为0.3356、0.8343和1.1474μg/mg。研究表明细胞摄取效率与电荷的正负无关,但与电荷的绝对值成正相关。当山嵛酸SLN的电荷为-8.1、-17.5和-24.9mV时,其对应的胞内摄取量分别为0.9597、1.0778和1.1474μg/mg。另外,研究显示电荷和粒径分别为7.1mV和501nm的山嵛酸SLN摄入RAW264.7细胞的浓度高于电荷和粒径为18.8mV和345nm的山嵛酸SLN,表明恩诺沙星-山嵛酸SLN的粒径比电荷更能显著影响其摄入细胞的效率。综上所述,最佳的细胞内靶向传递的纳米的粒径、电荷、分散指数、包封率和载药量分别为605nm、-24.9mV、0.241、95.9%和8.9%,其对应的处方为0.2g恩诺沙星,1.8g山嵛酸和10mL浓度为1%的PVA。3.恩诺沙星-山嵛酸SLN质量评价按照相应的指导原则对山嵛酸SLN纳米混悬液进行了制剂评价。试验结果表明恩诺沙星-山嵛酸SLN的外观为乳白色。放置于量筒中一周后产生的山嵛酸SLN悬液底部沉降物在20r/min的转速下能在1min内重新分散均匀。恩诺沙星-山嵛酸SLN悬液经9号针头的抽取速度为8.9mL/min,表明山嵛酸SLN悬液能顺利通过9号针头。恩诺沙星-山嵛酸SLN的沉降体积比和pH分别为1和6。影响因素试验显示恩诺沙星-山嵛酸SLN在强光照下,除了粒径和多分散系数有所增加外,混悬液的外观、重分散性、通针性、沉降体积比和pH值均没有明显改变,长期稳定性良好。恩诺沙星-山嵛酸固体脂质纳米在猪的注射部位无明显眼观病变,没有出现红肿、充血、渗出、变性或坏死等不良反应。溶血性试验显示恩诺沙星-山嵛酸SLN在3h内未发生溶血和凝聚,无溶血性。4.恩诺沙星-山嵛酸SLN体外胞内药效学研究成功构建沙门氏菌感染细胞体系后,加入1、4和10MIC的恩诺沙星-山嵛酸SLN,并设置恩诺沙星溶液为对照组,分别在加药后4、14、24和48h裂解细胞,涂布平板,对胞内菌进行计数。试验中测定了恩诺沙星-山嵛酸SLN对RAW264.7细胞内沙门氏菌CVCC541的抗菌活性。结果显示,在加药后4h,恩诺沙星-山嵛酸SLN对胞内沙门氏菌CVCC541有明显的抑制作用,并且随着孵育时间以及胞外添加药物浓度的增加,这种抑制作用显著强于对照组。当孵育时间从24h增加到48h时,1、4和10MIC的恩诺沙星-山嵛酸SLN组的菌落对数值分别从3.60、3.00和1.48CFU/mL变化为3.80、3.30和1.50CFU/mL,无明显增长;而1、4和10MIC的恩诺沙星组的菌落对数值从 5.04、3.95、3.04CFU/mL 分别增加到 6.91、5.65、4.15CFU/mL,呈显著增加。由此可见,恩诺沙星-山嵛酸SLN对胞内沙门氏菌的抑制作用更显著,持续抑制能力更强。5.恩诺沙星-山嵛酸SLN在猪体内药动学研究试验将24头健康猪随机分为4组,实验组和对照组各6头,分别按2.5mg/kg体重肌肉注射恩诺沙星-山嵛酸SLN和拜有利,以及按5mg/kg体重灌服恩诺沙星-山嵛酸固体脂质纳米和恩诺沙星可溶性粉。给药前采集空白血浆,给药后不同时间点采集血液,分离血浆,用HPLC检测血浆中恩诺沙星的浓度,Winnonlin软件拟合药动学参数。肌肉注射给药后,拜有利组血药浓度迅速增加,在给药后1h即达到峰浓度1.572±0.222μg/mL,接着血药浓度开始下降,到48h时检测到血药浓度已接近检测限,为0.024±0.011μg/mL;而恩诺沙星-山嵛酸SLN组给药后吸收缓慢,在肌注4h后才达到峰浓度0.746±0.074μg/mL,随后血药浓度缓慢下降,给药后120h山嵛酸SLN的血药浓度为0.034±0.01μg/mL,高于拜有利组48h的血药浓度。上述结果表明,恩诺沙星-山嵛酸SLN具有明显的缓释作用。恩诺沙星-山嵛酸SLN和拜有利达峰浓度(Cmax)分别为 0.685±0.059μg/mL 和 1.363±0.235μg/mL;消除半衰期(T1/2ke)分别为20.053±5.203h和6.326±0.889h;药时曲线下面积(AUC)分别为22.257±6.261h·μg/mL 和 13.603±2.106h·μg/mL;平均滞留时间(MRT)分别为37.761±4.460h和11.272±0.756h。山嵛酸SLN包裹恩诺沙星使恩诺沙星的相对生物利用度增加到163.62%。恩诺沙星可溶性粉经灌服后吸收较快,在给药后1h达到最大血药浓度1.166±0.079μg/mL,随后血药浓度开始下降,24h后测得血药浓度为0.150±0.029μg/mL,48h后血药浓度低于检测限;而恩诺沙星-山嵛酸SLN灌服后吸收缓慢,给药后4h才达到最大浓度0.924±0.194μg/mL,之后血药浓度缓慢下降,持续到给药后120h。恩诺沙星-山嵛酸SLN和恩诺沙星可溶性粉在猪血浆中相关药动学参数如下:达峰浓度(Cmax)分别为0.824±0.152μg/mL和1.027±0.059μg/mL;消除半衰期(T1/2ke)分别为12.058±5.470h和5.582±1.381h;药时曲线下面积(AUC)分别为23.559±3.669h·μg/mL 和 9.886±1.996h·μg/mL;平均滞留时间(MRT)分别为35.153±0.537h和12.330±1.558h;与可溶性粉相比,恩诺沙星-山嵛酸SLN的相对生物利用度为238.31%。综上所述,本课题成功研制出了恩诺沙星-山嵛酸SLN,并能显著提高RAW264.7细胞内恩诺沙星的浓度和停留时间以及对胞内沙门氏菌CVCC541的抗菌活性,在猪体内具有缓释作用且能显著增强恩诺沙星的生物利用度,为解决沙门氏菌等胞内菌感染的治疗难题提供新的可能性。