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大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌,它广泛存在于土壤表层、水体、家畜、家禽、蚊蝇以及肉类、乳与乳制品、水产品、豆制品、蔬菜、发酵食品等各种食品中。大肠杆菌在面对一些不利环境,如酸、碱、加热、低温、干燥、抗菌肽等,很可能形成独特的生理状态——亚致死性损伤状态。亚致死性损伤大肠杆菌难以彻底消除,会造成极大的食品安全隐患,已引起高度重视,成为近年来的研究热点。而乳酸本身具有抑菌作用,也可与其他防腐剂产生协同抑菌作用,已经广泛应用于食品领域;奶酪、酸奶、蛋黄酱等乳酸菌发酵食品中也有大量的乳酸存在;另外,肠道中的益生菌——乳酸菌,能通过分泌大量乳酸来抑制肠道中的大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长。乳酸亚致死性损伤大肠杆菌可能广泛存在于这些环境中。但是,目前对大肠杆菌的监控多数处于活菌研究状态,亚致死性损伤大肠杆菌的检测已经成为食品安全检测的热点和难点之一。因此,掌握大肠杆菌在乳酸胁迫情况下的生物学特性以及其亚致死性损伤状态的修复机制,为食品加工工业控制大肠杆菌的污染提供新的认识,对发展更加可靠的检测技术具有重要意义。本论文以食品及肠道中的常见菌——大肠杆菌为研究对象,首先研究乳酸亚致死性损伤大肠杆菌的产生情况及修复规律,考察乳酸亚致死性损伤程度与细胞膜通透性的关系,然后测定大肠杆菌在氧化应激代谢途径中的ROS水平、SOD及CAT活性、总谷胱甘肽含量的变化趋势,比较氧化应激基因缺陷株与野生株的培养基修复速率比,筛选缓解氧化应激途径中的修复调控基因。主要研究结果如下:(1)研究了不同pH值的乳酸溶液、温度、需氧量对大肠杆菌亚致死的影响。结果表明,不同pH值的乳酸对大肠杆菌亚损伤有极显著影响(P<0.01),当pH≥5.50,乳酸溶液不会导致大肠杆菌亚损伤;当pH≤3.00,大肠杆菌直接致死;当乳酸pH值为3.00-5.40,极可能存在乳酸亚致死性损伤大肠杆菌。乳酸亚损伤大肠杆菌的较佳制备条件为:37℃,125 r/min,乳酸pH值4.20,处理时间为60 min,最大亚致死率为99.15%。乳酸处理会导致大肠杆菌内含物外渗以及细胞膜的损伤,而且乳酸亚损伤程度与细胞膜通透性成正相关。在较佳制备条件下,大肠杆菌的细胞膜通透性变化率为92.91%。(2)研究了rpoS、rssB、uvrY、phoQ、arcA等感应基因的缺失对大肠杆菌耐酸性的影响。结果表明,rpoS、rssB、uvrY、phoQ的缺失造成大肠杆菌的耐酸性下降,在60 min时,相应的缺陷株的亚致死率分别为:99.66%、99.10%、99.62%、100%;然而,arcA基因的缺失增强了大肠杆菌的耐酸能力,ΔarcA在60 min时的亚致死率为97.98%。(3)研究了修复温度、营养、外源添加物等多种因素对乳酸亚致死性损伤大肠杆菌修复的影响。结果表明,最佳修复温度为37℃,而在4℃条件下损伤大肠杆菌无法完成修复;损伤大肠杆菌的修复需要一定的营养条件,营养越丰富,修复率越快;外源添加物中,CAT、Zn2+、Mn2+、Fe2+对损伤大肠杆菌的修复都有显著性影响(P<0.05),而且1 mmol/L低浓度的Zn2+、Mn2+、Fe2+均对乳酸亚损伤大肠杆菌的修复起作用。乳酸亚损伤大肠杆菌经培养基修复后,细胞膜也同时得到修复。(4)测定了大肠杆菌在乳酸亚损伤过程及修复过程中的ROS水平、SOD及CAT的活力和总谷胱甘肽的含量。研究表明,大肠杆菌在乳酸亚损伤过程中会发生氧化应激,最大损伤程度时,损伤菌的ROS水平是正常菌的4.59倍;损伤菌完成修复后,其体内的ROS水平会下降到正常水平;发现,CAT是通过直接清除ROS和促进提高大肠杆菌内源CAT活力的方式来缓解氧化应激;Zn2+、Mn2+、Fe2+是通过提高大肠杆菌内源SOD活力的方式来缓解氧化应激。(5)研究了sodA/B/C、kat G/E、gshA/B等氧化应激基因的缺失对大肠杆菌耐酸性的影响。结果表明,sodA/B/C、katG/E、gshA/B的缺失造成大肠杆菌的耐酸性下降,在60 min时,相应的缺陷株的亚致死率分别为:99.28%、99.16%、99.47%、99.50%、99.54%、99.16%、99.13%。发现在清除ROS效果方面,Cu/ZnSOD、MnSOD比FeSOD更有效。结论:本研究发现,大肠杆菌在面对乳酸胁迫环境时,不仅会发生乳酸亚致死性损伤,还伴随着氧化应激反应,产生大量活性氧,改变细胞膜通透性。乳酸亚致死性损伤大肠杆菌的较佳制备条件为:37℃,125 r/min,乳酸pH值4.20,处理时间为60 min,最大亚致死率为99.15%。大多数金属离子能促进亚损伤菌的修复,特别是低浓度(1 mmol/L)的Zn2+、Mn2+、Fe2+对损伤大肠杆菌的修复都有显著性影响(P<0.05)。rpoS是总调控基因,对大肠杆菌的耐酸性不可缺少,而arcA的表达会抑制大肠杆菌的耐酸性。SOD、CAT作为大肠杆菌主要的抗氧化酶系,在其缓解氧化应激和提高耐酸性方面起着无可替代的作用。