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病原微生物能够感染宿主,如果没有进行及时的治疗,将对人体的健康产生严重的后果。目前对病原菌的治疗,主要是使用抗生素。但是,滥用抗生素和出现的超级抗药菌使得抗生素对病原菌的治疗效果越来越差。因此,通过新的途径治疗病原菌的感染极具学术价值和应用前景。三型分泌系统(Type three secretion system,T3SS)存在于多种革兰氏阴性致病菌中,它在致病菌侵染宿主细胞的过程中起到关键作用。因此,通过抑制T3SS的功能,从而有效拮抗病原菌,可能是治疗相关病原菌感染的有效手段。目前研究发现对T3SS的抑制不会杀死细菌,也不会引起菌体裂解及毒素裂解释放,将使宿主免受损伤。另外,对T3SS的抑制不会影响细菌的生长,使细菌无生存选择压力,不易产生抗性。因此,研发T3SS抑制剂能有效遏制耐药菌的产生。然而,因为T3SS分泌调控的具体机制目前尚不清楚,阻碍了该类药物的开发过程。所以深入揭示T3SS的分泌调控机制,能够扩大靶点筛选范围、促进新型T3SS抑制剂的研发。在肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Eschericha coli,EHEC)中,“开关蛋白”SepD/SepL能调控转运蛋白和效应蛋白的有序输出。目前研究发现二者任何一个的缺失都将导致效应蛋白的过分泌和转运蛋白无法分泌,同时也有研究发现SepL的羧基端能与Tir相互作用从而调控效应蛋白的转运。但对于SepD,目前未见其功能方面的研究报道。本论文围绕SepD,从筛选与之结合的蛋白开始,逐步研究SepD调控效应蛋白有序分泌的分子机制,以期阐明“开关蛋白”SepD/SepL调控效应蛋白分泌的机制,找出该调控机制的关键作用靶点,进而促进新型T3SS抑制剂的研发。本论文通过GST pull down的方法筛选SepD相互作用蛋白,发现SepD与CesT之间存在相互作用。之后通过GSTpull down实验,逐步片段化SepD、CesT,筛选二者的结合功能域,发现SepD 30aa到35aa这一区域是一个与CesT相互作用的结合功能域,CesT α3是CesT与SepD相互作用的结合功能域。而且T3SS分泌实验的结果显示SepD 30aa到35aa这一区域的缺失将导致SepD依然能调控转运蛋白的分泌,但无法调控效应蛋白的分泌,同时,T3SS分泌实验的结果也显示CesTα3的缺失将导致效应蛋白Tir无法分泌。除此之外,绿色荧光蛋白测定实验显示,SepD与CesT的相互作用也能促进SepL的表达。根据SepD、CesT相互作用结合功能域的缺失所导致的效应蛋白分泌的改变,并结合文献,本文提出了 SepD/SepL调控效应蛋白分泌的调控机制猜想图。