目的:骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是严重威胁中老年人群,尤其是绝经后女性的一种全身性骨病,如何有效防治骨质疏松已成为当今国内外学者热切关注的课题。绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis, PMOP)是原发性骨质疏松症中的最常见类型,发生于绝经后女性,虽然目前尚无确切流行病学资料数据,但美国第3次全国营养与健康调查显示,全国50岁以上女性OP患病率13%-18%。加拿大OP多中心研究随机调查结果显示女性腰椎OP和股骨颈OP患病率分别为12.1%和7.9%,总患病率为15.8%。20世纪90年代,欧洲29个研究中心(英国后来也加入)进行前瞻性OP研究(骨密度测量和腰椎变形研究),根据世界卫生组织(WHO)诊断标准测量50岁以上女性人群股骨颈和粗隆间骨密度,结果显示欧洲女性OP患病率为2%-11%,挪威50岁以上妇女中有14%-36%患OP。我国学者采用分层多阶段整群抽样方法对中国五大行政区的40岁以上人群进行调查,应用双能X线骨密度仪(Dual-energy X-ray absorptiometry, DXA)测量骨密度(Bone Mineral Density, BMD),并按照WHO诊断标准,发现OP总患病率为12.4%,其中男性为8.5%,女性为15.7%,两者之间的差异有统计学意义。骨质疏松症发病机制非常复杂,机体的骨重建失衡目前被认为是骨质疏松发生的根本机制。骨重建是指去除骨骼局部旧骨代之以形成新骨的过程,是成熟骨组织的一种重要替换机制,是破骨细胞与成骨细胞一个成对的、相耦联的细胞活动过程。破骨细胞(osteoclast, OC)是骨吸收的主要细胞,它的多少及活性直接决定骨吸收能力。成骨细胞(osteoblast, OB)是促进骨形成的细胞。骨吸收和骨形成的速率构成骨转换率。骨重建过程受到遗传、内分泌、年龄和细胞因子等诸多因素影响,女性绝经是骨质疏松发生的主要病因之一,越来越多的证据表明T2DM影响骨代谢,造成骨转换率及骨量改变,使骨折危险性升高,T2DM对绝经后骨质疏松的骨重建及骨转换影响还不清楚。在维持骨重建的动态平衡中,系统或局部骨生长调节因子发挥着重要作用,研究发现Wnt信号通路在成骨细胞的发育及分化过程中扮演重要角色。人类遗传学和动物研究表明,Wnt/低密度脂蛋白受体相关蛋白5(The low density lipoprotein receptor-related protein 5, LRP5)/β-连环蛋白(β-catenin)是骨量形成的重要调节因子。tunt相关基因2(Runx2)是骨形成的关键基因,Runx2的表达是成骨细胞开始分化的标志。信号转导通路Wnt/LRP5/β-catenin涉及Runx2活性或表达的调控。而核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路是在破骨细胞分化时的信号转导途径,核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)的信号可经核因子-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)传递给连接蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)活化NF-κB,NF-κB再通过下游的活化T细胞核因子1蛋白(nuclear factor of activated T cell 1, NFATc1 )调节破骨细胞的形成。因此Wnt和NF-κB信号通路的相关因子表达改变可影响骨形成和骨吸收的动态平衡,导致骨质疏松的发生。我国2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)患病率快速增长,且年龄越大,患病率越高。资料显示2型糖尿病影响骨转换,导致骨折危险性增高。2型糖尿病和绝经后骨质疏松关系并不清楚。本研究通过制备2型糖尿病骨质疏松大鼠模型,测定骨密度及骨转换生化标记物,体外培养成骨细胞和破骨细胞,观察骨组织基因mRNA表达,并结合临床试验探讨2型糖尿病骨质疏松症特点,为阐明2型糖尿病骨质疏松发生的分子学机制及防治提供一条新思路。方法:动物实验:第一部分:健康雌性Wistar大鼠100只,适应性喂养1周后随机分为对照组(NS,n=24),去卵巢组(NOVX,n=26),2型糖尿病组(DS,n=24),2型糖尿病去卵巢组(DOVX,n=26),组间大鼠体重无统计学差异,其中糖尿病组(DS和DOVX)高糖高脂饲料(常规饲料中加入20%蔗糖、15%熟猪油、2.5%胆固醇)喂养8周后腹腔给予链脲佐菌素(streptozotocin,STZ 0.1mmol/L,柠檬酸钠配制,pH4.2) 30mg/kg注射制备2型糖尿病动物模型,无糖尿病组(NS和NOVX)注射相同体积的柠檬酸缓冲液。1周后选取尾静脉取血测空腹血糖(FBG)≥7.8mmol/L确定为T2DM动物模型,糖尿病模型复制成功1周后无菌条件下NOVX和DOVX组大鼠麻醉后行双侧卵巢切除手术,NS和DS组仅去除部分脂肪,以去卵巢术当天为基值,0周各组大鼠测血糖(FBG)、胰岛素(FINS),计算胰岛素敏感指数(IAI)。0、4、8和12周末雌激素(E2)水平、腰椎骨密度(BMD)。第二部分:于去卵巢术后第0、4、8、12周末每组大鼠随机选取5只拉颈处死行成骨细胞和破骨细胞体外培养,倒置显微镜下观察成骨细胞数量、形态变化,传代至第三代时碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞,并用MTT法判断成骨细胞生长活力。破骨细胞培养7天后,固定细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP)染色,倒置相差显微镜下每孔计数。同期内眦静脉取血测定骨特异性碱性磷酸酶(Bone Alkaline Phosphatase, BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)浓度。第三部分:于去卵巢术后第4、8、12周末,每组大鼠随机选取5只分离胫骨置液氮冷冻后-80℃保存备用,提取总RNA时取出骨组织约100mg快速放入研钵中,加1mL Trizol裂解液磨碎,参照Trizol RNA提取试剂说明书进行,反转录后以适量cDNA为模板扩增Runx2、LRP5、β-catenin、TRAF6、NF-κB、NFATc1的mRNA表达。PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上200v恒压电泳1h,溴化乙锭溶液染色10min,应用凝胶成像图像分析系统进行吸光度扫描,计算相对表达量与β-actin比值。临床试验部分:选取150例门诊查体无糖尿病绝经后女性,年龄50-70岁,绝经年限2-14年;150例我院内分泌科住院2型糖尿病女性绝经患者,年龄48-70岁,绝经年限1-14年,符合1999年WHO糖尿病诊断标准。双能X线骨密度测定仪(DXA)测定两组人群腰椎2-4(L2-4)、股骨颈(Neck)、大转子(Great T)、粗隆间(InterTro)骨密度(BMD),比较各部位骨量及骨质疏松发生率情况。依照1998年WHO原发性骨质疏松诊断标准,将糖尿病组所有入选患者分为骨量正常组(NP)、骨量减低组(DP)和骨质疏松组(OP),登记年龄(Age),绝经年限(PMD),糖尿病病程(DMD),测定身高、体重,计算体重指数(BMI)。随机血样测定糖化血红蛋白(HbA1c)。静脉血化验空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FIns)、雌激素(E2),Ⅰ型胶原C端肽(CTX-I)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)、骨特异性碱性磷酸酶(BALP)。探讨绝经后2型糖尿病患者骨质疏松发生的影响因素和骨转换特点。结果:动物实验第一部分:①血糖(FBG):0周时糖尿病组(DS、DOVX)大鼠FBG显著高于非糖尿病组(NS、NOVX) ( p<0.05)。②胰岛素(INS)和胰岛素敏感指数(IAI):0周时糖尿病组(DS、DOVX)大鼠胰岛素明显高于非糖尿病组(NS、NOVX) (p<0.05),0周时糖尿病组(DS、DOVX)大鼠胰岛素敏感指数均明显低于非糖尿病组(NS、NOVX)( p<0.05)。③雌激素(E2):0周时DOVX和DS组大鼠明显低于NOVX和NS组(p<0.05);4、8和12周时DOVX组大鼠明显低于NS、NOVX和DS组(p<0.05),NOVX组大鼠明显低于NS组(p<0.05);8和12周DS组大鼠明显低于NS组(p<0.05)。④骨密度(BMD):4、8和12周DOVX、NOVX组大鼠骨密度均明显低于NS组与DS组(p<0.05),8和12周DS组大鼠明显低于NS组(p<0.05)。动物实验第二部分:①BALP:0周时各组大鼠血清BALP均未见明显差异(p>0.05)。4周时DOVX组大鼠血清BALP浓度与NS组比较无明显差异(p>0.05),与NOVX组比较明显减低(p<0.05),与DS组比较无明显差异(p>0.05);NOVX组大鼠血清BALP浓度明显高于NS组(p<0.05);DS组血清BALP浓度与NS组比较无明显差异(p>0.05)。8周时DOVX组大鼠血清BALP浓度与NS和NOVX组比较无明显差异(p>0.05),与DS组比较明显升高(p<0.05);NOVX组血清BALP浓度与NS组比较无明显差异(p>0.05);DS组血清BALP浓度明显低于NS组(p<0.05)。12周时各组血清BALP浓度均无明显差异(p>0.05)。②TRACP5b:0周时各组大鼠血清TRACP5b均未见明显差异(p>0.05)。4周和8周时DOVX组TRACP5b浓度均明显高于NS组(p<0.05),与DS组和NOVX组比较均无明显差异(p>0.05);NOVX组TRACP5b浓度明显高于NS组(p<0.05);DS组TRACP5b浓度明显高于NS组(p<0.05)。12周时DOVX组TRACP5b浓度明显高于NS组、NOVX组、DS组(p<0.05);NOVX和DS组TRACP5b浓度分别与NS组比较均无明显差异(p>0.05)。③成骨细胞增殖活力:4、8和12周时DOVX组大鼠成骨细胞生长活力与NS组比较无明显差异(p>0.05),与NOVX组比较明显减低(p<0.05),与DS组比较明显增高(p<0.05);NOVX组大鼠成骨细胞生长活力明显高于NS组(p<0.05);DS组大鼠成骨细胞生长活力明显低于NS组(p<0.05)。④破骨细胞计数:4、8和12周时DOVX组大鼠破骨细胞计数明显高于NS和DS组(p<0.05);NOVX组大鼠破骨细胞计数明显高于NS组(p<0.05);DS组大鼠破骨细胞计数明显高于NS组(p<0.05)。动物实验第三部分:①Wnt信号通路相关因子表达:4、8和12周时DOVX大鼠LRP5和β-catenin表达均明显低于NS组(p<0.05);4周时DOVX大鼠Runx2表达与NS组比较无明显差异(p>0.05),8和12周时DOVX大鼠Runx2表达均明显低于NS组(p<0.05)。4、8和12周时NOVX大鼠LRP5和β-catenin表达均明显低于NS组(p<0.05);4和12周时NOVX大鼠Runx2表达明显低于NS组(p<0.05),8周时NOVX大鼠Runx2表达与NS组比较无明显差异(p>0.05)。4和8周时DS组大鼠LRP5和β-catenin表达均明显低于NS组(p<0.05),12周时DS组大鼠LRP5表达明显低于NS组(p<0.05),β-catenin表达与NS组比较无明显差异(p>0.05)。4和8周时DS组大鼠Runx2表达与NS组比较无明显差异(p>0.05),12周时DS组大鼠Runx2表达明显低于NS组(p<0.05)。②NF-κB信号通路相关因子表达:4、8和12周时DOVX组大鼠TRAF6、NF-κB和NFATc1表达均明显高于NS组(p<0.05)。4周时NOVX组大鼠TRAF6表达明显低于NS组(p<0.05),NF-κB表达明显高于NS组(p<0.05),NFATc1表达与NS组比较无明显改变(p>0.05),8和12周时NOVX组大鼠TRAF6、NF-κB和NFATc1表达均明显高于NS组(p<0.05)。4周时DS组大鼠TRAF6表达明显低于NS组(p<0.05),NF-κB和NFATc1表达均明显高于NS组(p<0.05);8周时DS大鼠TRAF6表达与NS组比较无明显改变(p>0.05),NF-κB和NFATc1表达均明显低于NS组(p<0.05);12周时DS组大鼠TRAF6和NF-κB表达明显高于NS组(p<0.05),NFATc1表达与NS组比较无明显变化(p>0.05)。临床研究部分:①绝经后2型糖尿病患者骨质疏松患病率为54%;②绝经后2型糖尿病患者各部位骨量与无糖尿病患者比较无明显差异;③绝经后2型糖尿病骨质疏松组患者年龄、绝经年限、糖尿病病程及空腹血糖水平明显高于骨量减少和骨量正常组(OP vs NP,p<0.05;OP vs DP,p<0.05),胰岛素和雌激素水平明显低于骨量减少和骨量正常组(OP vs NP,p<0.05;OP vs DP,p<0.05);年龄、绝经年限、糖尿病病程及空腹血糖与骨密度呈负相关,胰岛素和雌激素水平与骨密度呈正相关;④2型糖尿病骨质疏松组患者CTX-I、TRACP5b、BALP水平明显高于骨量减少和骨量正常组(OP vs NP,p<0.05;OP vs DP,p<0.05),CTX-I与腰椎2-4、股骨颈骨密度呈明显负相关(p<0.05),与大转子、粗隆间骨密度无明显相关性;TRACP5b、BALP与腰椎2-4、股骨颈、大转子、粗隆间骨密度呈明显负相关(p<0.05),TRACP5b与各部位骨密度相关性最强。结论:1实验性2型糖尿病大鼠双侧卵巢切除4周成功建立2型糖尿病骨质疏松大鼠模型;2 2型糖尿病大鼠骨量低于正常大鼠;2型糖尿病卵巢切除大鼠骨量与卵巢切除大鼠骨量无明显差异;3 2型糖尿病骨质疏松大鼠重建特点表现为:骨形成稳定,骨吸收活跃,其发生发展与糖尿病和卵巢切除有关;4 Wnt信号通路与NF-κB通路影响2型糖尿病骨质疏松大鼠骨重建,Wnt信号通路中β-catenin表达下降与NF-κB通路中NF-κB表达增强可能为2型糖尿病骨质疏松发生的重要分子生物学机制之一;5绝经后2型糖尿病患者骨质疏松患病率54%。年龄增长、绝经年限和糖尿病病程延长、空腹血糖增高和长期血糖控制不理想、胰岛素缺乏和雌激素降低增加绝经后2型糖尿病患者骨质疏松的危险;骨吸收标记物TRACP5b可作为预测绝经后2型糖尿病骨质疏松的早期敏感指标。