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免疫抑制作为机体负性免疫调节的主要过程,其诱导对肿瘤免疫,移植排斥反应和自身免疫性疾病的发生、发展、转归有着重要的影响。它的发生涉及到免疫应答过程中任何一个正、负调节系统。克隆不应答、免疫活性细胞激活受阻、缺乏辅助细胞和抑制细胞的作用、其他抑制免疫细胞的抑制作用。树突细胞作为免疫系统最有效的抗原呈现细胞,在免疫反应的启动和免疫反应的调节过程中起着决定性作用。在实验室前期的工作中发现体外培养的人卵巢癌细胞能引导树突细胞免疫耐受在此基础上对卵巢癌细胞引导的免疫抑制树突细胞进行基因芯片分析,发现RGS1基因表达明显上调。因此,我们调查RGS1基在抗肿瘤免疫抑制方面的作用。
第一部分:鼠RGS1基因功能的鉴定
实验首先建立了鼠RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞系,然后通过NF-κB-荧光素酶共转染,流式细胞仪检测,基因芯片分析及RT-PCR方法从转录因素、细胞表面分子的表达及细胞因子的分泌三个方面探讨了RGS1基因的功能。结果表明鼠RGS1基因明显抑制RAW264.7细胞NF-κB转录因素的活性,升高细胞表面CD40、CD86、B7-H1和PD1分子的表达,降低CD80表达。同时对细胞因子IL6、IL10、IL12的表达也有明显的影响,其中IL6的表达升高;IL10、IL12的表达降低。在经过不同的Tolllikereceptor配体(LPS、POLYI:C、PGN、BDNA)刺激后,比较鼠RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞与对照细胞系,RGS1基因明显抑制了各种Tolllikereceptor配体(LPS、POLYI:C、PGN、BDNA)对RAW264.7细胞的活化作用,说明RGS1基因可能对Tolllikereceptor途径存在的负性调节作用。
第二部分:人RGS1基因成功克隆与功能的初步鉴定
实验通过RT-PCR方法克隆了人RGS1基因,用InvitrogenpcDNA3.1/V5-His(C)TOPO(R)TAExpressionKit将其连接到pcDNA3.1/V5表达载体。然后以连接的质粒为基础通过化学发光及ELISA方法对人RGS1基因的功能进行了初步的研究。结果显示RGS1对293T细胞转录因素NF-κB的活性有明显的抑制作用,同时改变树突细胞细胞因子IL6、IL10、IL12的表达。初步证明了人RGS1基因功能的实验也同样存在免疫调节功能。
鼠RGS1基因在单核巨噬细胞系中表现出明显的负性免疫调节作用,同时对于不同Tolllikereceptor途径(TLR2、TLR3、TLR4、TLR9)对细胞的激活作用也均有明显的抑制。同时对于人RGS1基因功能的初步研究也显示出类似结果。证明RGS1基因很可能是免疫调节及免疫耐受过程中还没有发现的重要基因,对于RGS1基因功能的进一步研究可能对于搞清免疫调节的分子机理及免疫治疗的研究有重要作用。