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本研究在国家自然科学基金（No.30973885）及江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目（No.FJGJS-2015-12）的支持下完成,主要围绕乳香、没药有效部位的制备工艺优化,有效部位配伍对缺血性中风的改善作用与机制研究等,以期为该药对的进一步开发利用奠定基础。主要研究内容与结果简述如下:一、文献研究较为系统的归纳整理了乳香和没药的主要有效成分及药理活性,分析发现,乳香的主要有效成分为乳香酸类成分,包括五环三萜、大环二萜类成分等;没药的主要有效成分包括单萜类、倍半萜类、二萜类、三萜类,而以倍半萜类成分为主。现代药理活性研究表明,乳香、没药均具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等多种生物活性。为乳香、没药的进一步开放利用提供了科学依据。通过对缺血性中风的中医认识、病因病机及中风损伤的机制进行归纳总结,发现该疾病与去极化、钙超载、氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等关系密切,为试验研究提供了理论指导。二、乳香没药有效部位的制备工艺研究1.乳香-没药配伍的中医临床应用特点分析通过数据挖掘方法分析乳香、没药药对在方剂中的配伍应用规律,将中医方剂数据库中含有乳香、没药的2236首方剂信息读取出来。统计出乳香-没药的配伍比例有50种,其中1:1、2:1、1:2、2:3、3:2、5:3、3:4等7个比例出现频次较高,而以1:1形式配比的方剂高达1863首,故进一步围绕乳香-没药为1:1的方剂,对其所治疗疾病的科属、方剂功效和剂型及其网络关联性进行挖掘分析。结果发现,乳香、没药配伍多用于外科疾病,主要功效为活血化瘀、敛疮生肌、止痛、祛风、消痈散结、解毒、接骨续筋等,主要剂型为散剂、丸剂、膏剂等。2.乳香-没药不同配伍比例化学成分溶出分析应用UPLC-TQ/MS联用技术对乳香-没药不同配伍比例（1:1、1:2、2:1、2:3、3:2、3:4、5:3）的化学成分溶出变化进行分析。结果表明,乳香-没药不同配伍比例的化学成分溶出量不同,且配伍比例为1:1和2:1时溶出化学成分种类最为丰富,成分含量最高或较高。3.乳香中乳香三萜酸类成分的提取纯化工艺优化采用UPLC-TQ/MS检测,以乳香中13个乳香三萜酸类成分（3-羰基甘遂-8,24-二烯-21-酸、3α-乙酰甘遂-7,24-二烯-21-酸、3-羟基甘遂烷-8,24-二烯-21-酸、乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸、3α-羟基甘燧烷-7,24-二烯-21-酸、11-酮基乳香酸、3-O-乙酰基-α-乳香酸、3α-乙酰氧基-羊毛甾-8,24-二烯-21-酸、3β-乙酰氧基-5α-8,24-羊毛甾二烯-21-酸、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、3-乙酰基甲氧基甘遂-8,24-二烯-21-羧酸、α-乳香酸、β-乳香酸）的提取量及浸膏得率为评价指标,通过单因素及响应曲面考察提取方法、提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数对乳香提取工艺的影响;采用碱溶酸沉法纯化乳香提取物并对纯化工艺参数进行单因素和正交试验考察,确定最佳纯化工艺为:95%乙醇20倍量回流提取4次,每次62 min为最佳提取工艺;以碱液pH为12～13溶解,在0～4℃用酸液pH<2酸沉30 min为最佳纯化工艺,乳香三萜酸类成分纯度可达73.87%。4.没药中倍半萜类成分的提取纯化工艺优化采用UPLC检测,以没药中2个倍半萜（2-甲氧基-8,12-环氧吉马烷-1（10）,7,11-三烯-6-酮、2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉马烷-1（10）-烯-6-酮）的提取量及浸膏得率为评价指标,通过单因素及响应曲面考察提取方法、提取溶剂、料液比、提取时间及提取次数对没药提取工艺的影响;采用硅胶柱层析法纯化没药提取物并对纯化工艺参数进行单因素试验考察,确定最佳纯化工艺为:92%乙醇7倍量回流提取2.5 h/次,提取2次为最佳提取工艺;将乙酸乙酯部位用300-400目硅胶纯化,上样量为1:40,先用石油醚（PE）除杂,再用石油醚-乙酸乙酯（PE:EA）20:1的溶液作为洗脱剂洗脱3-6 BV为最佳纯化工艺,倍半萜类成分纯度可达 61.43%。三、乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用及机制研究1.乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的改善作用采用中脑动脉闭塞（MCAO）建立SD大鼠缺血性中风模型,通过神经功能评分确定模型建立成功,即模型大鼠出现提尾时损伤对侧前肢不能伸直;向损伤侧旋转;向对侧倾倒;不能自发行走,意识不清等。以乳香总三萜酸与没药倍半萜（BA-MS）的不同配伍比例（10:1、5:1、20:1,由药材配伍比例1:1、1:2、2:1折算）每天给药两次,给药3天后,收集血浆、尿液及脑/肺样本,分别进行生化指标测定、脑梗死面积测定,脑、肺组织病理学分析及Western blot法分析脑组织中AngI/AngII/Tie2信号通路与TLR4/NF-KB信号通路,以及免疫组化分析TDP-43,NeuN,TGF-β1,VWF和bFGF的蛋白表达。结果表明,BA-MS给药后能改善神经功能评分,改善脑梗死面积,减轻脑组织形态水肿,神经元丢失,核固缩程度,改善肺泡结构;调节TLR4/NF-κB信号通路和Ang/Tie信号通路,从而降低相关神经炎症因子（IL-1β、nNOS）、神经营养因子（BDNF、NGF）、的表达和促进相关血管生成生长因子（ET-1、VEGF、PDGF、AngⅡ、PAI-1）的表达,发挥缺血性中风的保护作用,其中H10:1与H20:1效果最佳。2.基于代谢组学研究乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的调节作用与机制基于代谢组学方法研究乳香三萜酸与没药倍半萜的不同配伍比例（BA-MS）对缺血性中风的干预作用,对大鼠血浆及尿液样本进行分析,发现配伍比例在H10:1和H5:1的效果最好,鉴定出了 21种内源性代谢物（血浆9种,尿液12种）,并进一步构建出14条相关代谢通路（影响值大于0.1）,即视黄醇代谢,戊糖和葡萄糖醛酸转换,亚油酸代谢,甘油磷脂代谢,生物素代谢,抗坏血酸和醛酸代谢,氨基酸代谢（苯丙氨酸代谢、丙酮酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢）,萜类化合物生物合成,泛酸和CoA生物合成,醚脂类代谢,鞘脂类代谢,半乳糖代谢,花生四烯酸代谢,甾体激素生物合成等代谢途径,其中以亚油酸代谢途径可能性最大（impact=1）。且相关性分析,提示给药干预后,可能通过调节亚油酸的代谢来降低IL-1β和VWF的表达,从而发挥对缺血性中风的改善作用。3.乳香-没药有效部位配伍对SD大鼠MCAO模型的肠道微生物的调节作用通过16S rDNA测序的方法研究乳香三萜酸与没药倍半萜的不同配伍比例（BA-MS）对缺血性再灌注的MCAO大鼠肠道菌群多样性的调节作用。研究发现,与假手术组相比,模型组大鼠肠道菌群相对丰度从门分类水平到属分类水平均发生了变化;在门水平上,H5:1显著降低MCAO大鼠放线菌门和无壁菌门;在属水平上,H20:1显著降低杜氏藻属,臭味菌;H5:1显著升梭状芽胞杆菌、柯林斯氏菌、大肠杆菌属、乳酸杆菌属、norankfLachnospiraceae和gnorankoMollicutesRF39;H10:1、L10:1、H5:1、H20:1显著降低副萨特氏菌属Parasutterella;YXY显著升高Pygrnaiobacter。可见,BA-MS具有改善缺血性中风大鼠肠道菌群失调的作用,总体而言,H5:1的效果最佳。对各组大鼠盲肠内容物中的6种短链脂肪酸（SCFAs）进行测定。模型组大鼠肠道内短链脂肪酸含量较假手术组相比显著下降。给药后,H5:1组对逆转缺血性中风大鼠肠道内容物乙酸和丙酸含量作用显著,说明其可能通过提高缺血再灌注后大鼠肠道内容物中乙酸和丙酸的水平实现对缺血性中风肠道损害的改善作用。肠道微生物与SCFAs的相关性分析发现,异戊酸（IVA）与norankfLachnospiraceae、clostridiumsurico1呈正相关（r≥0.4）;乙酸（AA）与乳酸杆菌属呈正相关（r≥0.4）,乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）与副萨特氏菌属呈负相关（r≤-0.4）。提示H5:1组可能是通过提高乳酸杆菌属和norankfLachnospiraceae的相对丰度,降低副萨特氏菌属的相对丰度,实现对缺血性中风肠道损害的改善作用。四基于细胞模型的乳香-没药有效部位配伍的生物效应与机制探讨1.乳香-没药有效部位不同配伍比例对LPS诱导的PC12细胞的保护作用采用MTT法评价7个不同配伍比例提取物（1:1、2:1、1:2、2:3、3:2、5:3、3:4）和有效部位（10:1、20:1、5:1、20:3、15:1、50:3、15:2）对 LPS 诱导的 PC12 细胞损伤;通过ELISA分析对炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18以及疼痛指标ENK、SP物质评价7个不同配伍比例提取物的抗炎镇痛活性。结果表明7个不同配比提取物和有效部位对LPS环境下的PC12细胞均有一定的保护作用,尤其是对IL-6有非常显著的抑制活性（P<0.001）,且配伍比例为1:1和5:3的效果较优。2.乳香-没药有效部位不同配伍比例对LPS诱导的BV2细胞的影响研究通过建立LPS诱导BV2细胞的神经炎症模型,MTT分析乳香三萜酸与没药倍半萜配伍（BA-MS）不同比例对BV2细胞的毒性,q-PCR法测定IL-1β、IL-6、iNOS mRNA的表达及Western blot法分析TLR4/NF-κB/PI3K/AKT信号通路。结果表明当浓度大于12.5 ug·mL-1,BV2细胞生长受到不同程度的抑制,抑制率与浓度呈正相关。且BA-MS均有不同程度的抑制IL-1β、IL-6、iNOS mRNA 的表达和减弱 p-NF-κB/NF-κB、p-AKT/AKT、TLR4等蛋白表达,以及促进p-PI3K蛋白表达,其中5:1效果最佳。3.基于网络药理学研究乳香-没药有效部位不同配伍比例的神经保护作用与机制通过UPLC-TQ/MS测定的乳香三萜酸与没药倍半萜配伍（BA-MS）不同比例的含量,与生化指标（第四章第二节）构建皮尔逊相关性分析,获得对神经炎症起治疗作用的重要贡献成分,并对获得的贡献成分进行网络药理分析。结果表明2-甲氧基-5-乙酰氧基-呋喃吉马-1（10）-烯-6-酮（2-methoxy-5-acetoxy-fruranogermacr-1（10）-en-6-one）、3α-乙酰羊毛甾8,24-二烯-21-酸（3α-acetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic acid）、11-酮基-乳香酸（11-keto-boswellicacid）、3-乙酰-11-酮基-β-乳香酸（3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid）是贡献的活性成分,且作用于31个神经炎症相关靶点,其中PI3K、AKT、IL-6已在第四章第二节证实了;涉及32条信号通路,其中包括第四章第二节的Toll样信号通路。