【摘 要】
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九香虫（Coridius chinensis）是我国一种重要的药食两用昆虫,属于昆虫纲半翅目兜蝽科兜蝽属,具有理气止痛、温中助阳之功能。溶菌酶（lysozyme）是一种糖苷水解酶,又称胞壁质酶（muramidase）,广泛存在于自然界,具有抗菌、消炎、抗病毒和消化等多种作用。该研究用第三代测序技术测定了九香虫全长转录组,基于这个数据克隆了一种九香虫溶菌酶基因CcLys的cDNA,进行了CcLys的
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九香虫（Coridius chinensis）是我国一种重要的药食两用昆虫,属于昆虫纲半翅目兜蝽科兜蝽属,具有理气止痛、温中助阳之功能。溶菌酶（lysozyme）是一种糖苷水解酶,又称胞壁质酶（muramidase）,广泛存在于自然界,具有抗菌、消炎、抗病毒和消化等多种作用。该研究用第三代测序技术测定了九香虫全长转录组,基于这个数据克隆了一种九香虫溶菌酶基因CcLys的cDNA,进行了CcLys的特征分析及表达模式解析,在毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行了分泌表达,对表达的CcLys进行了抗菌活性检测。该研究为进一步明确CcLys基因的功能、开发新型抗菌药物以及深度挖掘九香虫资源奠定基础。1、九香虫全长转录组测序及分析用PacBio Sequel平台对九香虫进行了全长转录组测序,获得55,021个转录本,其中41,258个转录本为已知基因。九香虫转录本与茶翅蝽（Halyomorpha halys）的转录本相似性最高,为79.77%。10,456个转录本（19.00%）在基因本体论（GO）数据库中分成55个功能群,14,680个转录本（26.68%）在蛋白质同源聚簇（COG）数据库中分成25个功能群,27,752个转录本（50.44%）在代谢数据库（KEGG）被注释到44个代谢通路。从转录本中预测出36,126个编码序列（CDS）和19,353个简单重复序列（SSR）。2、九香虫溶菌酶基因CcLys的克隆及特征分析九香虫溶菌酶基因CcLys的cDNA长883 bp,包含一个669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸。CcLys蛋白的N-端包含一段由18个氨基酸组成的信号肽,成熟CcLys形成7个α-螺旋,8个β-折叠片的三维结构。同源性和聚类分析显示CcLys与茶翅蝽（Halyomorpha halys）溶菌酶的亲缘关系最近。基因表达谱分析表明,CcLys在九香虫的整个发育阶段都有表达,在3龄若虫中表达水平最高;该基因在所检测的成虫组织中都有表达,在脂肪体中表达水平最高。成虫被细菌诱导后,CcLys的表达水平在12 h达到峰值。3、CcLys基因的分泌表达及抗菌活性检测根据毕赤酵母密码子使用的偏爱性,对成熟CcLys蛋白的核苷酸序列进行优化,两端加Xho I和Xba I酶切位点后进行人工合成。双酶切后,将优化后的序列克隆到表达载体p PICZαA上,构建重组表达载体p PICZαA-CcLys,在毕赤酵母GS115中实现分泌表达。对表达产物进行抗菌活性检测,结果表明九香虫溶菌酶CcLys对枯草芽孢杆菌具有抗菌活性。
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