胃癌是严重威胁人类生命健康的主要疾病之一，当前已经成为全球重大的公共卫生问题。在我国胃癌发病率和死亡率均占消化系统恶性肿瘤的第一位。由于胃癌的早期症状不典型，当患者出现明显不适症状时，病情往往已经发展的较晚，失去了行根治性手术的机会，对于这部分患者，化疗成为其治疗的主要手段。虽然近年来不断研究出新的化疗药物及改进的联合化疗方案，但胃癌患者的化疗效果仍然不尽如人意。胃癌的多药耐药（multidrug resistance，MDR）往往是导致化疗治疗效果欠佳的主要原因之一。MDR发生的机制较为复杂，而且受到多种因素影响，研究逆转MDR的有效方法已经成为提高化疗疗效的关键。因此，如何逆转胃癌的MDR，提高胃癌化疗疗效，成为当前胃癌研究中的热点，也是临床胃癌治疗中急待解决的问题。蛋白质组学（Proteomics）是以基因编码的所有蛋白质组为研究对象，从整体水平上分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，进而揭示蛋白质功能及其与细胞生命活动规律的关系。蛋白质组学的技术体系是以双相凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）为主的蛋白质分离技术和以质谱（mass spectrometry，MS）、生物信息学（Bioinformatics）为主的蛋白质鉴定技术。本实验共分为四部分，第一部分应用siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞中ZNF139表达及并研究其对化疗药物敏感性影响；第二部分应用siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139表达及并研究其对化疗药物敏感性影响。通过第一、二部分的研究，得出应用siRNA能够抑制人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139的表达，抑制ZNF139的表达后能够提高胃癌细胞对于化疗药物的敏感性。第三部分应用蛋白质组学技术对siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中前后的差异蛋白进行分离鉴定，寻找与ZNF139参与胃癌发生、发展及多药耐药有可能相关的蛋白。通过第三部分的研究，得出ZNF139有可能通过PDXK、ANXA2及Fascin而参与胃癌的发生、发展及多药耐药。第四部分应用qRT-PCR及Western blot法检测各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin的表达情况。通过第四部分的研究，得出ZNF139有可能通过促进ANXA2、Fascin的表达及抑制PDXK的表达来参与胃癌的发生、发展及多药耐药等过程。本课题四部分的具体内容如下：第一部分：siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞中ZNF139表达及其对化疗药物敏感性影响的研究目的：以人胃癌SGC7901细胞为研究对象，检测siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞前后ZNF139的表达情况，并研究其对化疗药物敏感性的影响。方法：1设计合成针对ZNF139的小干扰RNA，构建siRNA-ZNF139表达质粒。培养人胃癌SGC7901细胞，应用siRNA-ZNF139质粒转染人胃癌SGC7901细胞。2qRT-PCR检测各实验组人胃癌SGC7901细胞中ZNF139mRNA表达水平的变化。3Western blot法检测各实验组人胃癌SGC7901细胞中ZNF139蛋白表达水平的变化。4MTT法检测各实验组人胃癌SGC7901细胞对于化疗药物敏感性的变化。结果：1各实验组人胃癌SGC7901细胞中ZNF139mRNA表达水平的变化。分别用3个阳性质粒及阴性对照质粒以浓度为0.8μg/μl转染人胃癌SGC7901细胞48小时，依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中ZNF139mRNA的相对表达量最高，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；1号阳性质粒组中ZNF139mRNA的相对表达量为最低，且其与空白对照组ZNF139mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。各实验组中以1号阳性质粒组ZNF139的抑制效率最高，为84.41%。选用1号阳性质粒，以0.4μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl、1.0μg/μl的浓度梯度转染人胃癌SGC7901细胞48小时，依据结果发现空白对照组ZNF139mRNA的相对表达量最高；浓度为0.8μg/μl组的ZNF139mRNA的相对表达量最低，且其与空白对照组ZNF139mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P <0.05）。各实验组中以浓度0.8μg/μl组ZNF139的抑制效率最高，为84.42%。选用浓度为0.8μg/μl的1号阳性质粒，分别转染胃癌细胞24小时、48小时、72小时，依据结果发现空白对照组ZNF139mRNA的相对表达量最高；转染48小时实验组的ZNF139mRNA表达量最低，且其与空白对照组ZNF139mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P <0.05）。各实验组中以转染48小时实验组ZNF139的抑制效率最高，为84.36%。2各实验组人胃癌SGC7901细胞中ZNF139蛋白表达水平的变化。应用Western blot法检测各实验组ZNF139蛋白表达水平的变化。实验结果与qRT-PCR结果一致。3各实验组人胃癌SGC7901细胞对于化疗药物敏感性的变化依据前面实验部分得到结果，选用0.8μg/μl浓度的1号阳性质粒及阴性对照质粒，转染人胃癌SGC7901细胞48小时后，应用MTT法检测各实验组人胃癌SGC7901细胞对于5-FU、ADR、CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16这7种化疗药物敏感性的变化。依据结果发现空白对照组与阴性对照组中相互之间各自比较细胞平均抑制率，差异无统计学意义（P>0.05）。siRNA-ZNF139组中各自较空白对照组细胞平均抑制率明显升高，且二者之间比较差异有统计学意义（P <0.05）。结论：1siRNA能够抑制人胃癌SGC7901细胞中ZNF139mRNA的表达。2siRNA能够抑制人胃癌SGC7901细胞中ZNF139蛋白的表达。3siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞中ZNF139的表达能够提高胃癌细胞对于5-FU、ADR、CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16这7种化疗药物的敏感性。第二部分：siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139表达及其对化疗药物敏感性影响的研究目的：以人胃癌SGC7901细胞裸鼠原位移植瘤为研究对象，检测siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤前后ZNF139的表达情况，并研究其对化疗药物敏感性的影响。方法：1人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立及干预收集体外培养的人胃癌SGC7901细胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，传代5次，获取生长旺盛的第6代皮下移植瘤，将第6代皮下移植瘤应用OB生物胶粘贴法进行原位移植。术后每日观察裸鼠腹部切口、进食及腹腔原位移植瘤生长情况。待原位移植瘤长至直径约10mm左右时，分别随机按照空白对照组、siRNA-ZNF139组、siRNA-ZNF139+奥沙利铂组、奥沙利铂组及阴性对照组进行干预。干预期间，隔日测量一次瘤体长、短径，并按照V=ab2/2（a为瘤体长径，b为瘤体短径）计算原位移植瘤体积。干预处理两周后，取出原位移植瘤。2qRT-PCR检测各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139mRNA表达水平的变化。3Western blot法检测各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白表达水平的变化。4MTT法检测各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤对于化疗药物敏感性的变化。结果：1人胃癌裸鼠原位移植瘤模型干预后的形态观察干预处理两周后，统计各实验组原位移植瘤体积（V=ab2/2，a为瘤体长径，b为瘤体短径）。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中原位移植瘤的体积最大，且二者之间差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139+奥沙利铂组中原位移植瘤的体积最小，且其与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；siRNA-ZNF139组与空白对照组原位移植瘤的体积比较差异有统计学意义（P<0.05）；siRNA-ZNF139组与siRNA-ZNF139+奥沙利铂组原位移植瘤的体积比较差异有统计学意义（P<0.05）；奥沙利铂组与空白对照组原位移植瘤的体积比较差异有统计学意义（P<0.05）；奥沙利铂组与siRNA-ZNF139+奥沙利铂组原位移植瘤的体积比较差异有统计学意义（P<0.05）；siRNA-ZNF139组与奥沙利铂组原位移植瘤的体积比较差异无统计学意义（P>0.05）。2各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139mRNA表达水平的变化依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中ZNF139mRNA的相对表达量最高，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中ZNF139mRNA的相对表达量为最低，且其与空白对照组ZNF139mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。siRNA-ZNF139组ZNF139的抑制效率为81.05%。3各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白表达水平的变化应用Western blot法检测各实验组ZNF139蛋白表达水平的变化。实验结果与qRT-PCR结果一致。4各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤组织对于化疗药物敏感性的变化应用MTT法检测各实验组人胃癌裸鼠原位移植瘤组织细胞对于5-FU、ADR、 CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16这7种化疗药物敏感性的变化。依据结果发现空白对照组与阴性对照组中相互之间各自比较细胞平均抑制率，差异无统计学意义（P>0.05）。siRNA-ZNF139组中各自较空白对照组细胞平均抑制率明显升高，且二者之间比较差异有统计学意义（P <0.05）。结论：1siRNA-ZNF139能够抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤的生长。2siRNA能够抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139mRNA的表达。3siRNA能够抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白的表达。4siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139的表达能够提高原位移植瘤组织对于5-FU、ADR、 CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16这7种化疗药物的敏感性。第三部分：siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139表达的蛋白质组学研究目的：以人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤为研究对象，通过双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等蛋白质组学技术研究各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中差异蛋白的表达情况。方法：应用双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术分别分离各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤蛋白质，选择差异点，并用Ettan spot picker挖取，挖取点行胶内酶解，应用液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定技术对挖取的蛋白质点鉴定，并对鉴定出的蛋白质进行分析。结果：人胃癌SGC7901细胞双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）图谱上蛋白质点为1958±67个，匹配率为90.5%，人胃癌裸鼠原位移植瘤2D-DIGE图谱上蛋白质点为5227±59，匹配率为88.7%。在人胃癌SGC7901细胞中选取8个差异明显的蛋白点，经由LC-MS鉴定出6种蛋白质：吡哆醛激酶（pyridoxal kinase，PDXK）、结蛋白（Desmin）、核磷蛋白（nucleophosmin，NPM）、热休克蛋白70（heat shockprotein70，HSP70）、膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）、和Fascin。在siRNA-ZNF139转染后的人胃癌SGC7901细胞中PDXK、Desmin、NPM表达上调，HSP70、ANXA2、Fascin表达下调。在人胃癌裸鼠原位移植瘤中选取6个差异明显的蛋白点，经由LC-MS鉴定出5种蛋白质：ANXA1、PDXK、Fascin、ANXA2、不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）。在siRNA-ZNF139转染后的人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA1、PDXK表达上调，Fascin、ANXA2、hnRNP表达下调。结论：1在siRNA-ZNF139转染后的人胃癌SGC7901细胞中PDXK、Desmin、NPM表达上调，HSP70、ANXA2、Fascin表达下调。2在siRNA-ZNF139转染后的人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA1、PDXK表达上调，Fascin、ANXA2、hnRNP表达下调。3ZNF139可能通过调节PDXK、ANXA2及Fascin而参与胃癌的发生、发展及多药耐药。第四部分：siRNA-ZNF139对人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin表达影响的研究目的：以人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤为研究对象，检测各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin的表达情况。方法：1培养人胃癌SGC7901细胞，应用siRNA-ZNF139质粒转染人胃癌SGC7901细胞。2人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立及干预3qRT-PCR检测各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin mRNA表达水平的变化。4Western blot法检测各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin蛋白表达水平的变化。结果：1各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin mRNA表达水平的变化应用qRT-PCR检测空白对照组、siRNA-ZNF139组及阴性对照组中人胃癌SGC7901细胞中PDXK mRNA表达水平的变化。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中PDXK mRNA的相对表达量较低，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中PDXK mRNA的相对表达量为最高，且其与空白对照组PDXK mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。应用qRT-PCR检测空白对照组、siRNA-ZNF139组及阴性对照组中人胃癌SGC7901细胞中ANXA2mRNA表达水平的变化。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中ANXA2mRNA的相对表达量最高，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中ANXA2mRNA的相对表达量为最低，且其与空白对照组ANXA2mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。应用qRT-PCR检测空白对照组、siRNA-ZNF139组及阴性对照组中人胃癌SGC7901细胞中Fascin mRNA表达水平的变化。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中Fascin mRNA的相对表达量最高，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中Fascin mRNA的相对表达量为最低，且其与空白对照组Fascin mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。应用qRT-PCR检测空白对照组、siRNA-ZNF139组及阴性对照组中人胃癌裸鼠原位移植瘤中PDXK mRNA表达水平的变化。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中PDXK mRNA的相对表达量较低，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中PDXKmRNA的相对表达量为最高，且其与空白对照组PDXK mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。应用qRT-PCR检测空白对照组、siRNA-ZNF139组及阴性对照组中人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA2mRNA表达水平的变化。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中ANXA2mRNA的相对表达量最高，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中ANXA2mRNA的相对表达量为最低，且其与空白对照组ANXA2mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。应用qRT-PCR检测空白对照组、siRNA-ZNF139组及阴性对照组中人胃癌裸鼠原位移植瘤中Fascin mRNA表达水平的变化。依据结果可以发现空白对照组与阴性对照组中Fascin mRNA的相对表达量最高，且二者之间表达差异无统计学意义（P>0.05）；siRNA-ZNF139组中FascinmRNA的相对表达量为最低，且其与空白对照组Fascin mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。2各实验组人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin蛋白表达水平的变化。应用Western blot法检测各实验组PDXK、ANXA2及Fascin蛋白表达水平的变化。实验结果与qRT-PCR结果一致。结论：1siRNA-ZNF139转染人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK mRNA的表达水平上升，ANXA2mRNA及Fascin mRNA的表达水平降低。2siRNA-ZNF139转染人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK蛋白的表达水平上升，ANXA2蛋白及Fascin蛋白的表达水平降低。3ZNF139有可能通过促进ANXA2、Fascin的表达及抑制PDXK的表达来参与胃癌的发生、发展及多药耐药等过程。综合上述四部分实验内容，本研究小结如下：1siRNA能够抑制人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139mRNA的表达。2siRNA能够抑制人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白的表达3siRNA抑制人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139的表达能够提高胃癌细胞对于化疗药物的敏感性。4siRNA-ZNF139能够抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤的生长。5在siRNA-ZNF139转染后的人胃癌SGC7901细胞中PDXK、Desmin、 NPM表达上调， HSP70、 ANXA2、 Fascin表达下调。在siRNA-ZNF139转染后的人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA1、PDXK表达上调，Fascin、ANXA2、hnRNP表达下调。6siRNA-ZNF139转染人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK mRNA的表达水平上升，ANXA2mRNA及Fascin mRNA的表达水平降低。7siRNA-ZNF139转染人胃癌SGC7901细胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK蛋白的表达水平上升，ANXA2蛋白及Fascin蛋白的表达水平降低。8ZNF139有可能通过促进ANXA2、Fascin的表达及抑制PDXK的表达来参与胃癌的发生、发展及多药耐药等过程。