论文部分内容阅读
冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病,CAD)是目前我国最常见、最重要的引起死亡和致残的疾病之一。许多研究证实ATP结合盒转运子(ATP binding cassette transporter)家族的成员ABCAl. ABCG1介导细胞内胆固醇和氧化固醇转运至乏脂或无脂的HDL前体载脂蛋白AI(ApoAl)以及成熟HDL.ABCG1在介导胆固醇外流至HDL的过程中发挥着重要作用。最近研究显示在动脉粥样硬化的发生发展过程中,ABCGl参与了巨噬细胞的凋亡和内皮细胞功能的紊乱,这说明ABCG1在动脉粥样硬化形成过程中扮演着重要角色。但总的来说,ABCG在动脉粥样硬化发病中的作用还很不明确。有研究发现ABCG1启动子-257T>G多态性与CAD严重程度有关。本研究旨在探讨ABCG1启动子区和3’非编码区(3’-UTR)的四个单核苷酸多态性(SNP)位点-768G>A(rs2234714)、-530A>G(rs2234715)、-367G>A(rs57137919)2424A>G(rs1044317)多态性与中国患者脂代谢异常及冠心病发病的相关性,阐明冠心病患者巨噬细胞内胆固醇沉积的分子生物学机制。研究目的1.研究中国汉族人群冠心病患者和正常对照人群中ABCG1基因启动子区(-768G>A、-530A>G、-367G>A)和3’ -UTR(2424A>G)SNP位点基因型和等位基因频率的差异,探索其与冠心病发病的相关性。2.根据遗传学分析结果,选择-768G>A和-367G>A两个位点构建野生型和突变型萤光素酶报告质粒,比较野生型与突变型报告质粒对ABCG1基因转录活性的影响。3.比较不同基因型-367AA/AG/GG冠心病患者外周血原代单核细胞来源的巨噬细胞ABCG1的表达情况。研究方法1.收集1013例健康受试者和1021名CAD患者(其中心肌梗死患者672例)的静脉血,提取基因组DNA,应用基因测序和聚合酶链反应----连接酶检测反应(PCR-LDR)方法检测ABCG1基因启动子区和3’-UTR的四个SNP位点-768G>A(rs2234714)、-530A>G(rs2234715)、-367G>A(rs57137919)和2424A>G(rs1044317)基因型,观察健康对照组、冠心病组和心肌梗死组这些位点基因型频率及其与血脂、CAD或心肌梗死发病的相关性；2.根据病例对照研究的结果,选择-768G>A和-367G>A两个位点构建野生型和突变型萤光素酶报告质粒,体外培养THP-1、RAW264.7、293T细胞及人外周血单核巨噬细胞,应用双萤光素酶报告系统检测野生型与突变型报告萤光素酶质粒(pGL3-basic/P-GG、pGL3-basic/P-GA、pGL3一basic/P-AG与pGL3一basic/P-AA)的转录活性。3.体外培养不同基因型(-367AA/AG/GG) CAD患者外周血单核巨噬细胞ABCG1蛋白表达情况。4.统计方法：连续变量符合正态分布计量资料以均数±标准差表示,采用独立样本t检验；不符合正态分布的,以中位数(25百分位-75百分位)表示,采用Mann-Whitney U检验。分类变量基因型／等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡检验采用chi-squared检验或者Fisher’s精确检验；校正年龄、性别、高血压、2型糖尿病、吸烟、HDL-C和TG潜在混杂因素后,采用多因素logistic回归分析,计算调整后的0R值和95%%可信区间。所有数据应用SPSS13.0软件分析,p<0.05(two-tailed)为差异有统计学意义。所选SNPs的配对连锁不平衡检验采用SHEsis软件计算D’值和r2值,采用PHASE软件(version 2.1)计算单体型频率。回顾性统计学效力使用Epi InfoTM软件(version 3.5.1)计算。病例组和对照组之间统计学差异OR小于1.45,p<0.05时统计学效力大于80%。研究结果1.本对研究四个SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡。2.ABCG1基因启动子区rs57137919多态位点劣性基因型AA与冠心病发病风险下降显著相关(OR=0.77,95%CI0.60-0.97,p=0.026)。而冠心病或心梗组rs57137919位点劣性等位基因A的频率显著低于对照组(p=0.006或p=0.004)。logistic回归分析显示,在显性模型中,A等位基因的携带者(AG+AA)冠心病或心梗发病风险显著低于GG纯合子(CAD组：校正后OR=0.73,p=0.033；心梗组：校正后OR=0.65,p=0.014)。rs57137919位点还与冠心病的严重程度相关。与单支病变组相比,多支病变组等位基因A冠心病风险显著下降(校正后的OR=0.40,p=0.005)。在THP-1、RAW264.7、HEK293T及人外周血单核巨噬细胞中,萤光素酶报告质粒试验验证了ABCG1启动子区-367G>A,ABCG1基因转录活性下降(P<0.05)。-367AA基因型CAD患者外周血单核-巨噬细胞ABCG1蛋白表达水平显著低于-367GG基因型患者(p<0.001)。3.冠心病组或心梗组rs2234714位点劣性等位基因A的频率显著低于对照组(p=0.05或p=0.0046),在隐性模型中rs2234714位点与冠心病或心梗发病风险下降相关(CAD组校正后OR=0.64,p=0.015；心梗组校正后OR=0.49,p=0.001)。但在萤光素酶报告质粒试验ABCG1启动子区-768G>A, ABCG1基因转录活性未见明显下降(P>0.05)。4.其他两个位点rs2234715and rs1044317的等位基因频率或基因型分布在冠心病患者和健康受试者中无统计学差异。5.在未服用降脂药的受试者中,rs57137919和rs2234714多态位点与血浆脂质水平无显著相关。6.单体型A-A-A-A(rs2234714-rs2234715-rs57137919-rs1044317)与心肌梗死的发病风险下降显著相关(校正后OR=0.59,95%CI0.37-0.93,p=0.023)。研究结论ABCG1-367AA基因型ABCGl的转录活性及蛋白表达较GG. GA基因型减低,推测是ABCG1-367G>A AA基因型和A等位基因系冠心病发病保护性因子。这是在全世界的首次人体研究,发现ABCG1与动脉粥样硬化疾病发病呈负相关,提示ABCG1可能促进冠心病发病。