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背景:胃癌是严重威胁人民身体健康的癌症之一,其死亡率在肿瘤相关死亡中居于第二位。胃癌的预后与临床分期密切相关,临床Ⅰ-Ⅱ的患者5年生存率可达到90%,而临床Ⅲ-Ⅳ的患者5年生存率却不足10%。因此对于胃癌的早期发现,早期诊断,早期治疗,有助于降低胃癌的死亡率。对胃癌机制的探讨可以帮助我们寻求早期干预胃癌的手段。幽门螺杆菌(H.pylori)被认为是引起胃癌的重要病原因子,1994年WHO就将H.pylori定义为Ⅰ类致癌因子。H.pylori感染机体后定居在胃粘膜表面,产生毒力因子,破坏胃粘膜,形成慢性炎症,在细胞DNA损伤修复的过程中,癌基因被激活,逐渐由炎症向癌症转变。尽管研究不断深入,但关于H.pylori感染诱导的胃粘膜组织发生炎癌演化的具体机制仍然有待进一步探讨。胃粘膜恶性转化的过程通常经过慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎伴肠化生、非典型性增生和胃癌等不同阶段。研究已经表明H.pylori感染可以激活NF-κ B,NF-κ B进一步调控下游癌基因和抑癌基因的表达,涉及到宿主细胞众多非编码RNA,蛋白质等生物活性分子。MicroRNAs(miRNAs)是一类不编码蛋白质的单链小RNA,与靶基因mRNA的3’端非编码区碱基互补结合,在转录后水平抑制基因的表达。大量研究证实miRNA参与调控肿瘤相关基因,参与调控肿瘤细胞的重要生物学行为,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。miRNA与肿瘤的发病密切相关。表达异常的miRNA,通过对靶基因的调控,参与胃癌发生过程。通过信息学预测miRNA-136受NF-κ B调控,miRNA-136下游调控的基因是PDCD11。目前研究发现miRNA-136在小细胞肺癌中表达升高,发挥癌基因的作用。研究表明PDCD11可以诱导FasL的转录,从而促进Fas/FasL介导的细胞凋亡,PDCD11还被证实可以促进前核糖体RNA的加工和成熟,核糖体的生物合成障碍会增加癌症的易感性。PDCD11表达异常有可能参与癌症的发生和发展过程。虽然目前关于miRNA-136和PDCD11在胃癌发生和发展中作用尚未见有文献报导,但是通过对文献的回顾学习结合生物信息学的预测,本文假设H.pylori可能通过激活NF-κ B,调控miRNA-136和PDCD11表达,在胃癌的发生和发展中发挥作用。本文以此为切入点,探讨H.pylori调控miRNA-136和PDCD11的表达在胃癌发生中的分子机制,为诊断和治疗胃癌提供新手段。目的:探讨miRNA-136和PDCD11在人胃癌组织中的表达及其与H.pylori感染的关系,与临床病理特征和预后的关系。探讨H.pylori调控miRNA-136和PDCD11的分子机制。通过对机制的探讨寻求诊断和治疗胃癌的新手段。方法:1.miRNA-136和PDCD11在胃癌组织中的表达及1临床意义收集30例胃癌组织及癌旁组织标本。qRT-PCR检测miRNA-136和PDCD11mRNA的表达水平;Western blot检测PDCD11蛋白的表达水平。统计分析miRNA-136和PDCD11在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异,统计分析miRNA-136和PDCD11表达相关性,miRNA-136和PDCD11与临床病理因素的关系,与H.Pylori感染的关系,Kaplan-Meier生存分析评估miRNA-136和PDCD11与胃癌生存预后的关系。2.H.pylori对miRNA-136和PDCD11表达的影响H.Pylori(细菌数与细胞数之为比150:1、100:1、50:1)刺激胃癌细胞,12h后收集细胞;H.Pylori(细菌数与细胞数之比100:1)刺激胃癌细胞,分别在6、12、18、24小时收集细胞,提取RNA和蛋白,qRT-PCR检测miRNA-136和PDCD11mRNA表达,Western blot检测PDCD11蛋白的表达。观察H.Pylor对miRNA-136和PDCD11表达的影响是否存在时间和浓度的依赖性。3.H.pylori激活NF-κB调控miRNA-136 的表达生物信息学预测miRNA-136启动子区存在NF-κB结合位点,miRNA-136启动子报告载体和突变载体分别转染胃癌细胞,H.pylori刺激转染后的胃癌细胞,检测荧光强度。通过荧光强度的改变验证H.pylori是否通过激活NF-κB调控miRNA-136表达。通过NF-κB抑制实验进一步验证NF-κB是否参与H.pylori对miRNA-136表达的调控。4.miRNA-136靶向调控PDCD11影响胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭通过生物信息学预测miRNA-136和PDCD11的3’ UTR结合。荧光素酶实验验证miRNA-136和PDCD11 的3’ UTR结合。miRNA-136mimic和inhibitor分别转染胃癌细胞后,qRT-PCR检测PDCD11mRNA表达,western blot检测PDCD11 蛋白表达,CCK8检测胃癌细胞增殖,流式细胞术检测胃癌细胞凋亡,transwell侵袭实验观察胃癌细胞侵袭力。转染PDCD11过表达质粒,观察PDCD11过表达后对miRNA-136诱导的胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响。结果:1.miRNA-136和PDCD11在胃癌中的表达及临床意义胃癌组织中miRNA-136的表达水显著高于癌旁组织,而PPDCD11RNA和蛋白在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。胃癌组织和癌旁组织中miRNA-136与PDCD11蛋白表达均呈显著负相关。H.pylori阳性的胃癌组织miRNA-136的表达显著高于H.pylori阴性,而PDCD11mRNA和蛋白表达显著低于H.pylori阴性。miRNA-136在临床Ⅲ和Ⅳ期和有淋巴结转移的胃癌病例中,表达水平均显著高于Ⅰ-Ⅱ期和无淋巴结转移病例。PDCD11mRNA和蛋白在Ⅲ-Ⅳ期和有淋巴结转移胃癌病例中,表达水平均显著低于Ⅰ-Ⅱ期和无淋巴结转移病例。miRNA-136相对高表达和PDCD11的相对低表达的胃癌病例中位生存时间显著低于miRNA-136相对低表达和PDCD11的相对高表达的胃癌病例。2.H.Pylori对miRNA-136和PDCD11表达的调控H.Pylori对miRNA-136和PDCD11表达的调控具有时间依赖性和浓度依赖性,随H.Pylori刺激浓度的增加,作用时间的延长,miRNA-136的表达逐渐增高,PDCD11mRNA和蛋白的表达逐渐降低。3.H.Pylori激活NF-κB调控miRNA-136表达启动子预测结果显示,miRNA-136的启动子序列中含有NF-κB的结合位点。荧光素酶实验验证NF-κB与miRNA-136的启动子结合,NF-κB阻断实验验证NF-κB参与H.Pylori对miRNA-136表达的调控。4.miRNA-136靶向调控PDCD11影响胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭胃癌细胞转染miRNA-136mimic和pGL-PDCD11-wt,荧光素酶活性降低,但转染miRNA-136mimic和pGL-PDCD11-mut,荧光素酶活性无明显改变;转染miRNA-136inhibitor和pGL-PDCD11-wt,荧光素酶活性上调,但转染miRNA-136inhibitor和pGL-PDCD11-mut,荧光素酶活性无明显改变。转染miRNA-136mimic后qRT-PCR检测发现PDCD11mRNA的表达水平降低,western blot检测发现PDCD11蛋白的表达水平降低;转染miRNA-136inhibitor后qRT-PCR检测发现PDCD11mRNA的表达水平升高,Western blot检测发现PDCD11蛋白的表达水平升高。转染miRNA-136mimic后CCK8检测发现细胞增殖水平增高,流式细胞术检测发现细胞凋亡水平降低,transwell侵袭实验检测发现细胞侵袭力增强。转染miRNA-136inhibitor后CCK8检测发现细胞增殖水平降低,流式细胞术检测发现细胞凋亡水平增高,transwell侵袭实验检测发现细胞侵袭力减弱。结论:1.胃癌中miRNA-136表达增高,PDCD11表达降低。两者表达呈显著负相关。2.miRNA-136的高表达和PDCD11的低表达与H.Pylori感染相关,二者参与H.Pylori感染后的胃癌的发生过程。3.miRNA-136高表达和PDCD11低表达与胃癌的预后不良相关。4.H.pylori通过激活NF-κB上调miRNA-136表达,后者靶向抑制PDCD11表达,通过影响胃癌细胞的生物学行为,在胃癌发生中发挥重要作用。