日本落叶松CSE和DHN基因功能分析

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咖啡酰莽草酸酯酶(CSE)作为木质素单体生物合成重要酶之一,可通过调控木质素的合成来应对非生物胁迫。脱水素蛋白(DHN)是在脱水应激过程中过表达的亲水性蛋白,是参与抗逆胁迫的蛋白,与植物脱水的保护机制有关。本论文主要研究是日本落叶松(Larix kaempferi)CSE和DHN基因的功能。根据北美落叶松(Larix laricina)转录组数据,成功从日本落叶松茎中克隆得到了1条CSE基因和4条DHN基因,分别为Lk CSE、Lk DHN1、Lk DHN2、Lk DHN3和Lk DHN4。同源性序列比对和系统进化树表明Lk CSE很有可能具有催化活性,并且CSE可能存在于被子植物和裸子植物分化之前,但大多数单子叶植物在进化过程中丢失了;Lk DHN1、Lk DHN2、Lk DHN3和Lk DHN4均属于SK3型脱水素蛋白并可能具有抗逆性。通过烟草瞬时表达技术发现Lk CSE蛋白的亚细胞定位为内质网和质膜,Lk DHN蛋白的亚细胞定位主要在细胞核。利用原核载体和亲和层析技术成功表达纯化获得Lk CSE、Lk DHN、缺失K段的Lk DHN△K和缺失S段的Lk DHN△S突变蛋白。通过高效液相色谱法技术开展了日本落叶松Lk CSE的酶学性质研究,结果表明Lk CSE具有咖啡酰莽草酸酯酶的催化能力,可以水解咖啡酰莽草酸生成咖啡酸与莽草酸;Lk CSE蛋白最适反应温度和p H分别为30℃和6.0;Lk CSE的Km值为82.08μM,Vmax为13.04 n M min-1。通过凝胶阻滞实验结果显示了Lk DHN蛋白可以与DNA非特异性结合,可能具有保护或修复DNA的功能;缺失K段的Lk DHN△K与DNA的结合能力几乎消失了,表明K段在DHN与DNA互作中起到重要作用。本论文为日本落叶松CSE和DHN的进一步抗逆性研究提供了参考。
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