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粘膜免疫系统作为特异免疫防御的第一道防线保护机体免受病原体的侵袭。多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是在哺乳动物粘膜免疫中起着介导分泌性抗体在上皮细胞中转运一个重要的分子。在顶膜表面的分泌性抗体能够阻止病原体的粘附、入侵以及将病原体转运到粘膜分泌物中。
本研究采用同源克隆和RACE的技术方法,首次克隆到了斜带石斑鱼pIgR全长cDNA和基因组序列,并对其氨基酸序列、基因结构及重要的功能位点进行了分析;应用RT-PCR方法对pIgR mRNA在斜带石斑鱼各种组织中的表达情况进行了半定量分析;通过northern blot检测pIgR mRNA在斜带石斑鱼组织中的转录形式;建立了斜带石斑鱼pIgR蛋白的真核稳定表达体系,并检测pIgR蛋白在COS-7细胞中的定位,以及应用FACS间接免疫荧光法检测pIgR蛋白与IgM的结合能力;用大肠杆菌BL21中表达斜带石斑鱼SC(pIgR的胞外部分)成熟肽融合蛋白,再以此重组蛋白作为抗原制备斜带石斑鱼pIgR的抗血清。本文主要的研究结果如下:
1.斜带石斑鱼pIgR cDNA序列由1,440个核苷酸组成,带有1,020 bp的ORF。斜带石斑鱼pIgR蛋白是由339个氨基酸组成的一次跨膜受体,包括一个由20个氨基酸组成的信号肽、一个胞外区域、一个跨膜区域和一个由55个氨基酸组成的胞内区域。蛋白序列分析显示,斜带石斑鱼pIgR只有两个ILD,不具有保守的免疫球蛋白-结合位点(Ig-binding site)和CDR。斜带石斑鱼pIgR基因由8个外显子和7个内含子组成。同源性比对和进化树分析显示,与其他脊椎动物比,斜带石斑鱼pIgR和硬骨鱼的亲缘性更近一些,特别是鲈型目。
2.在除了嗅球、垂体、脂肪以外的其他斜带石斑鱼组织中都能检测到pIgR mRNA的表达。在斜带石斑鱼的外周组织中,pIgR mRNA表达于所有的粘膜组织。其中,皮肤、中后肠和胃中表达强度较高,而在鳃和前肠中表达强度较低。pIgR mRNA也存在于胸腺、头肾和脾脏这些淋巴器官中。在斜带石斑鱼的脑组织中,pIgR基因的端脑、小脑、上丘脑、下丘脑的分区中均有较高的表达量。
为了检测斜带石斑鱼pIgR的转录形式,进行了Northern blot,在斜带石斑鱼肠、脾脏和肾中检测到长度约1650bp的一个pIgR mRNA转录本,与斜带石斑鱼cDNA长度相近。
3.利用COS-7细胞稳定表达N-端带FLAG-标签的重组石斑鱼pIgR蛋白。分别制备稳定表达FLAG-pIgR的细胞系(pIgR-细胞)和对照细胞的细胞裂解液,以抗FLAG单抗为一抗的Western blot检测到一个40 kDa的特异性产物,此产物与预测石斑鱼pIgR蛋白的大小一致,证实此蛋白成功表达于COS-7细胞系。并且,通过FACS间接免疫荧光法证实,该pIgR重组蛋白是一个N端暴露于胞外的跨膜蛋白。
为了检测斜带石斑鱼pIgR与IgM的结合能力,将pIgR-细胞和对照细胞用天然斜带石斑鱼IgM孵育,进行流式细胞仪分析检测。结果显示,重组斜带石斑鱼pIgR具有结合IgM的能力。
4.将斜带石斑鱼SC(pIgR胞外部分)成熟肽克隆到pET-22b原核表达载体上,构建了重组载体pET-22b-SC。将此重组质粒转入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)后,再用lmMIPTG30℃条件下,诱导4小时,获得SC重组蛋白。用Western blot鉴定此重组蛋白确为斜带石斑鱼SC。利用蛋白作为抗原制备抗血清,并具有较高特异性。