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背景与目的食管癌是人类最常见的六大恶性肿瘤之一,具有显著的地域性分布差异,且预后极差。我国的食管癌死亡率最高,并且主要以鳞状细胞癌(ESCC)为主,高发区主要集中于河南、河北与山西省交界处,发病率由高到低呈同心圆向外分布。其中,河南林州市(原林县)及其毗邻的辉县等地是我国,也是世界上发病率最高的地区之一。食管鳞癌病因学研究得到广泛关注,研究表明其发生发展与环境污染、吸烟、饮食习惯、营养缺陷等多种环境因素密切相关。与其它实体性肿瘤一样,食管鳞癌的发生也是一个多基因多步骤的过程,包括癌基因的激活和抑癌基因的失活,多个与肿瘤发生相关的基因也被报道与食管鳞癌发生相关,如p53和Rb等。比较基因组杂交(CGH)技术和杂合性缺失(LOH)分析结果显示食管鳞癌3p常常存在缺失,提示该区域可能存在一个或多个肿瘤抑癌基因。一些位于3p的基因,如SEMA3B、FHIT、RASSFIA、CACNA2D2、DLEC1、PLC 61均被认为是候选肿瘤抑制基因。研究显示位于该区域的SEMA3B(信号素3B)基因在肺癌、乳腺癌组织中常发生等位缺失和表达下调,与肺癌、乳腺癌发生密切相关。实验表明SEMA3B基因具有诱导肺癌细胞凋亡,导致细胞集落形成率下降和降低裸鼠成瘤能力,说明SEMA3B对恶性肿瘤细胞的生长具有强烈抑制作用。但是,并未有文献报道该基因与ESCC发生发展的关系。本研究采用RT-PCR和免疫组化的方法分别在mRNA和蛋白水平检测SEMA3B在食管鳞状细胞癌中的表达情况,探讨其临床意义；并构建pcDNA3.1 (+)-SEMA3B真核表达载体,转染至SEMA3B基因表达缺失的人食管癌KYSE30细胞株中,并通过RT-PCR和western blot方法检测SEMA3B基因在转染基因后KYSE30细胞中的表达,为进一步研究SEMA3B在食管鳞癌发生发展中的作用机制奠定基础,以及对其进行靶向基因治疗提供了依据。材料与方法1.选取河南省安阳市肿瘤医院2007年3月至2007年12月间51例食管癌手术切除标本(同一例病例包括食管癌组织、5cm以外上的食管癌旁正常组织),HE切片病理证实为鳞癌。所有病例术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。2.应用RT-PCR方法检测51例食管鳞状细胞癌组织及其相应正常食管粘膜组织中SEMA3B mRNA的表达情况。采用免疫组织化学S-P法检测51例食管鳞状细胞癌组织及其相应癌旁正常食管粘膜组织中SEMA3B蛋白的表达情况。3.采用SPSS16.0统计软件,统计方法采用χ2检验或Fisher精确检验,检验水准为α=0.05。4.pcDNA3.1-SEMA3B真核表达载体的构建及鉴定。5.采用RT-PCR方法检查9株食管癌细胞株SEMA3B的表达,筛选SEMA3B表达缺失的细胞株。6.细胞培养及重组质粒转染KYSE30食管癌细胞。7.RT-PCR检测转染细胞中SEMA3B mRNA表达情况；western-blot检测转染细胞中SEMA3B蛋白表达情况。结果1. 51例食管鳞癌标本中,30例SEMA3B mRNA表达缺失,表达缺失率58.8%(30/51),51例癌旁正常食管组织中SEMA3B mRNA均表达；RT-PCR结果显示,SEMA3B在mRNA水平的表达缺失率在食管鳞癌及癌旁正常组织间的差异具统计学差异(P<0.05)。2. 51例食管鳞癌标本中,28例SEMA3B蛋白表达缺失,表达缺失率54.9%(28/51),51例癌旁正常食管组织中SEMA3B蛋白均表达；免疫组化结果显不,SEMA3B在蛋白水平的表达缺失率在食管鳞癌及癌旁正常组织间的差异具统计学差异(P<0.05)。3. 51例食管鳞癌标本中,有淋巴结转移组的SEMA3B蛋白表达缺失率为79.8%(15/19),高于无淋巴结转移组40.6%(13/32),二者之间差异有统计学差异(P<0.05)；侵及食管全层组SEMA3B蛋白表达缺失率85.7%(24/28)高于未侵及食管全层组17.4%(4/23),二者之间差异有统计学差异(P<0.05)；Ⅲ期食管鳞癌组SEMA3B蛋白表达缺失率92.9%(13/14),高于Ⅰ期食管鳞癌组0%(0/13)、Ⅱ期食管鳞癌组46.9%(15/32),三者之间的差异具有统计学差异(P<0.05)。4. 51例食管鳞癌标本中,SEMA3B蛋白表达异常与性别、年龄、大体分型、分化级别和发生部位无关(P>0.05)5.成功构建pcDNA3.1-SEMA3B真核表达载体,鉴定结果与预期结果完全一致。6.RT-PCR检测：SEMA3B成功转染至KYSE30细胞中,转染组SEMA3B mRNA含量明显高于对照组。7.Western blot结果显示：转染pcDNA3.1-SEMA3B重组质粒的细胞内SEMA3B蛋白表达量明显增高。结论1.食管鳞癌组织中SEMA3B呈现表达下调,其表达缺失与食管鳞癌淋巴结转移、侵袭和临床分期密切相关,提示SEMA3B可能与食管鳞癌的发生和进展过程有关。2.克隆人SEMA3B基因,pcDNA 3.1 (+)-SEMA3B真核表达载体构建及其转染KYSE30食管癌细胞均获成功,建立了稳定表达SEMA3B基因的细胞株,为进一步研究SEMA3B在食管鳞癌发生发展中的作用机制奠定基础。