菌根真菌Glomus mosseae中G.m14-3-3基因的研究

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14-3-3蛋白广泛分布于所有真核生物中,该蛋白结构高度保守,存在于细胞内不同区域,参与调控细胞内各种生命代谢过程。本文根据已发表的Glomus mosseae14-3-3基因EST序列,利用反向PCR和3’RACE技术克隆到了Gm14-3-3基因的ORF全长,上游约2 kb长的启动子区和5’UTR以及基因的3’UTR序列;在菌根真菌中发现编码相同蛋白质的基因产生两种具有长短不同3’UTR转录产物的现象,并将两种转录产物分别命名为G.m14-3-3L和G.m14-3-3S。通过生物信息学的方法对G.m14-3-3基因以及其编码的蛋白质进行了分析,结果显示它与其它真核生物中的14-3-3蛋白具有较高的同源性,预测的3D模型具有典型的14-3-3蛋白的结构特征。通过构建以egfp为报告基因的表达载体,对G.m14-3-3基因的putative启动子在酿酒酵母Y187中进行了活性分析,.结果表明该基因启动子片段能在酵母中发挥功能。根据序列分析结果,在G.m14-3-3L的3’UTR和G.m14-3-3的ORF区段分别设计特异性引物,利用实时荧光定量RT-PCR技术探索了G.m14-3-3L和G.m14-3-3S在Glomus mosseae的休眠孢子和共生期间菌丝两个不同生长阶段,以及共生期间分别受到重金属Cu、Cd胁迫和盐胁迫时的转录变化,主要结果如下:1)在休眠期的孢子和共生期菌丝中,Gm14-3-3总的mRNA转录量基本相同,但Gm14-3-3L mRNA在休眠期孢子中的含量是共生期菌根根内菌丝含量的1.5倍;2)在200 mg/kg浓度的重金属铜胁迫下,Gml4-3-3总的mRNA含量随着时间的增加呈现出先降低,后恢复到CK水平的现象,并在24h处理时转录量下降到CK的1/2,期间G.m14-3-3L和G.m14-3-3S的比例无明显变化;3)在浓度为60 mg/kg的重金属镉胁迫时,各种时长处理表现出的变化较小,90 mg/kg的镉处理一个月,G.m14-3-3基因的转录量是CK的1.7倍;4)盐胁迫处理条件下,没有观察到该基因在转录水平有明显变化。据此推测G.m14-3-3基因的表达受转录水平和转录后水平的调控,并在菌根真菌的生命代谢活动和抵抗环境胁迫中起着重要作用。此外,通过构建原核表达载体成功实现了G.m14-3-3基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达;通过在保守区段设计引物扩增到了实验室其余三个AM真菌Gigaspora margarita, Glomus intraradices, Gigaspora rosea中14-3-3基因的部分序列。本研究为后续研究菌根真菌中与14-3-3蛋白相关的信号通路以及利用14-3-3基因进行AM真菌菌种鉴定打下了基础。
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