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目的:通过观察电针对局灶性脑缺血再灌注小鼠大脑皮层γ-GCS蛋白及其mRNA表达的影响,探索氧化应激因子Nrf2在电针治疗脑缺血再灌注损伤的作用及机制,为临床电针治疗脑缺血再灌注损伤的机制提供新的理论依据。方法:选用野生型小鼠(WT)和Nrf2基因敲除小鼠(KO),按照随机数字表法分组,分为WT假手术组、WT模型组、WT电针组、KO假手术组、KO模型组、KO电针组。假手术组小鼠只分离血管,不插线栓,其余处理与模型组一样。模型组选用改良Longa线栓法制备小鼠右侧大脑中动脉闭塞模型,缺血2h后拔线栓。电针组小鼠拔线栓后进行电针“大椎”、“百会”,其中“百会”穴向右平刺,“大椎”穴约30°斜刺,深度约3-5mm,接入电针,“百会”穴接负极,“大椎”穴接正极,加疏密波,频率2/15 Hz,以针柄轻微颤动、穴区局部轻微抖动为度,连续治疗15 min。脑缺血再灌注24h后依据Julio氏神经行为学评分表评价小鼠功能活动;取小鼠大脑称量干湿比重,计算脑含水量;以及TTC染色,测定脑组织梗死体积。眼眶取血,分离上清液,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中GSH、GSSG含量和GSH/GSSG比值变化。采用免疫组化、RT-PCR技术,观察缺血侧皮层γ-GCS蛋白、γ-GCS mRNA表达情况。所有数据均采用SPSS 23.0计算。结果:1.小鼠脑缺血再灌注神经功能行为学观察与对应假手术组比,WT模型组、KO模型组、KO电针组神经功能显著降低(P<0.01);WT电针组神经功能评分为(13.20±1.30),与WT假手术组比较明显下降(P<0.05)。WT电针组与WT模型组比较有明显差异(P<0.05)。WT模型组与KO模型组进行比较,神经行为学有统计学意义(P<0.05),WT电针组较KO电针组统计学有显著差异(P<0.01)。2.小鼠脑缺血再灌注脑含水量测定模型组与电针组分别与对应的假手术组比较,均有显著差异(P<0.01)。电针之后WT组脑水肿情况有所缓解,含水量显著低于WT模型组(P<0.01)。KO小鼠造模之后,与WT小鼠比较,其脑含水量增加,比较有显著统计学差异(P<0.01)。WT电针组含水量与KO电针组相比,显著降低(P<0.01)。3.小鼠脑缺血再灌注脑组织梗死情况(TTC染色)小鼠再灌注24h后,假手术组TTC染色未见白色梗死灶,呈现均匀的红染。模型组与电针组呈现大小不一的白色梗死区域,但WT电针组白色区域较WT模型组、KO模型组、KO电针组要小。WT电针组梗死体积最小(22.97±2.44%),与模型组比较,差异显著(P<0.01)。WT模型组的脑梗死体积较KO模型组的要小,有统计学意义(P<0.05)。WT电针组脑组织白色区域显著低于KO电针组(P<0.01)。4.小鼠脑缺血再灌注脑组织病理形态观察40×10倍显微镜下可见:神经细胞胞浆呈淡红色,核呈蓝黑色。假手术组脑组织形态结构正常,可见神经锥体细胞数量多,胞浆丰富,细胞核大而圆,未见病理性损伤。WT模型小鼠缺血侧脑组织神经细胞胞体缩小变形,细胞核固缩深染,可见部分细胞胞核和胞浆界限不清,核固缩成三角形或不规则形。神经组织间质水肿明显,组织结构疏松淡染呈网状,甚至部分区域仅见红染的坏死组织而无明显细胞结构。WT电针组梗死灶较模型组明显减小,镜下病理改变不明显,细胞形态、大小基本正常,偶见不同程度变性神经细胞,脑组织水肿减轻。KO模型组和KO电针组细胞坏死明显,周围空泡大,质水肿,且细胞核溶解严重。5.小鼠脑缺血再灌注血清GSH、GSSG含量与GSH/GSSG 比值变化与WT假手术组相比,WT模型组血清GSH含量明显下降(P<0.05),GSSG含量显著升高(P<0.01),GSH/GSSG 比值显著下降(P<0.01);WT电针组的GSH含量明显升高(P<0.05),GSSG含量明显降低(P<0.05),GSH/GSSG 比值显著上升(P<0.01);而WT电针组GSH含量、GSH/GSSG 比值均显著高于WT模型组(P<0.01),GSSG含量显著降低(P<0.01)。与KO假手术组相比,KO模型组、KO电针组血清GSH含量、GSH/GSSG 比值显著下降(P<0.01),GSSG含量明显升高(P<0.05);而KO模型组、KO电针组组间GSH、GSSG含量、GSH/GSSG 比值均无明显差异(P>0.05)。KO模型组的血清GSH含量、GSSG含量和GSH/GSSG比值均显著低于WT模型组(P<0.01);KO电针组的血清GSH含量和GSH/GSSG 比值均显著低于WT电针组(P<0.01)。6.小鼠脑缺血再灌注缺损侧脑组织y-GCS蛋白表达情况从光学显微镜下观察脑缺血再灌注缺损侧脑组织γ-GCS蛋白阳性细胞可知,γ-GCS蛋白呈现棕黄色,在小鼠大脑皮层广泛存在,椎体细胞表达比较明显,假手术组可见黄褐色的阳性细胞,电针后阳性细胞染色明显加深。但是KO组小鼠偶见阳性细胞的表达,着色较浅,且细胞质、细胞核表达均不明显。各组假手术组中均可检测到阳性细胞。与WT假手术组比较,模型组阳性细胞个数较多,二者有显著统计学差异(P<0.01);WT电针组阳性细胞数目最多(33.00±3.39),显著高于WT模型组(P<0.01)。与KO假手术组相比,KO模型组、KO电针组阳性细胞数显著上升(P<0.01)。WT模型组阳性细胞数较KO模型组,显著升高(P<0.01)。WT电针组阳性细胞数较KO电针组亦显著升高(P<0.01)。WT模型组与KO模型组分别与对应的假手术比较,有统计学意义(P<0.05)。两组数值电针组分别与对应的假手术组比较,差异均显著(P<0.01),有统计学意义。WT模型组与WT电针组比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。WT模型组与KO模型组、WT电针组与KO电针组间的平均灰度、平均光密度值均有显著的统计学差异(P<0.01)。7.小鼠脑缺血再灌注缺损侧脑组织γ-GCS mRNA表达情况从RT-PCR检测γ-GCS mRNA表达水平结果示,WT假手术组与对应的模型组、电针组比,结果差异显著(P<0.01);且WT电针组脑组织内γ-GCS mRNA表达,也高于WT模型组(P<0.05)。与KO假手术组比较,KO模型组、KO电针组y-GCS mRNA表达均明显升高(P<0.05)。野生型小鼠的y-GCS mRNA表达量,不论假手术、模型还是电针,均显著高于相应的Nrf2基因敲除小鼠。结论:1.电针能明显改善WT小鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能损伤和脑组织形态,提示电针对缺血性脑血管疾病损伤的脑组织具有一定的保护作用。2.电针可以促进y-GCS蛋白表达上调,使得GSH含量增多,提示电针能通过促进抗氧化蛋白的表达,提高机体的抗氧化能力。3.电针Nrf2基因敲除小鼠,对于y-GCS蛋白的表达没有明显的改善,提示电针治疗脑缺血再灌注损伤调控γ-GCS蛋白的表达,与Nrf2密切相关。综上,本课题首次通过Nrf2基因敲除小鼠制备脑缺血再灌注模型,观察Nrf2信号通路对电针干预作用的影响,认为电针可通过Nrf2信号通路调控下游的γ-GCS基因和蛋白的表达,提升机体的抗氧化能力,发挥对缺血性脑血管疾病的保护作用,这为临床治疗脑血管疾病提供新思路。