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目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,早期诊断治疗被认为可以有效改善预后。胃癌的发生发展是多种因素相互作用的结果,包括遗传学,表观遗传学及环境因素等。表观遗传学指的是在生物体DNA序列不发生变化的前提下,基因的表达发生了改变,并且这种改变具有可遗传性,在细胞增殖和生物发育过程中能稳定传递给后代。目前关于表观遗传学的研究内容包括DNA的甲基化、组蛋白修饰以及MicroRNAs等。MicroRNAs是一类小分子RNAs,可以识别并结合靶基因,对生物体的发育,分化,增殖以及凋亡进行精确调控。MicroRNAs基因启动子区甲基化状态可以影响其表达水平,进而影响其多个靶基因的表达,最终对肿瘤的发生和发展产生重要影响。MicroRNA-320a(miR-320a)基因位于染色体8p21.3上,在多种血液恶性肿瘤以及实体恶性肿瘤中,miR-320a都能够发挥肿瘤抑制剂的作用。然而miR-320a在胃癌中的表达水平,调控机制,生物学功能及可能的靶基因均未见报道。MicroRNA-638(miR-638)基因位于染色体19p13.2上,有研究发现miR-638在多种肿瘤中均表达下降,提示miR-638可能在肿瘤的发生发展等过程发挥抑癌基因的作用。然而miR-638在胃癌中的抑癌机制尚未明确。本研究旨在探讨miR-320a和miR-638在胃恶性肿瘤细胞株及胃癌组织中的表达情况,分析miR-320a和miR-638表达水平与临床病理特征及预后生存率之间的关系。探讨miR-320a和miR-638在胃癌细胞及组织的甲基化状态及其对胃癌患者临床病理特征的影响,分析甲基化状态与胃癌患者预后之间的关系。同时我们还研究了miR-320a和miR-638对靶蛋白表达的调控作用,以及对胃癌细胞增殖,转移,侵袭以及凋亡的影响。研究方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测胃癌及癌旁健康组织,胃癌细胞系(SGC-7901,MKN-45,BGC-823,AGS)及正常人胃黏膜细胞(GES-1)中miR-320a和miR-638的表达水平,并分析其临床病理意义。MSP方法检测胃癌细胞,正常人胃黏膜细胞以及肿瘤组织中miR-320a和miR-638的基因启动子区甲基化水平。探究miR-320a和miR-638表达水平,miR-320a和miR-638基因启动子区甲基化水平与患者临床病理因素之间的关系。应用MTT检测不同miR-320a和miR-638表达水平对胃癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术分析不同miR-320a和miR-638表达水平对胃癌细胞凋亡的影响,Transwell侵袭实验分析不同miR-320a和miR-638表达水平对胃癌细胞侵袭能力的影响,划痕实验分析不同miR-320a表达水平对胃癌细胞迁移能力的影响,Westernblot以及荧光素酶报告基因实验分析miR-320a和miR-638对各自靶基因的调控。结果:1.以胃正常粘膜上皮细胞GES-1为对照,miR-320a在胃癌细胞系(SGC-7901,MKN-45,BGC-823,AGS)中的表达水平降低。miR-320a在胃癌组织中的表达较对应癌旁组织中的表达水平明显下降,差异明显,有统计学意义(P<0.05)。miR-320a的表达与淋巴结转移(P=0.011),肿瘤分化程度(P=0.026)以及TNM分期(P=0.001)密切相关。2.MSP法检测胃癌肿瘤及胃健康组织中miR-320a的甲基化水平,结果显示在6对miR-320a表达量下调的样本中,其中5对(83%,5/6)表现为肿瘤组织高甲基化状态。胃癌细胞系(SGC-7901,MKN-45,BGC-823,AGS)中miR-320a的甲基化水平高于正常胃粘膜上皮细胞GSE-1。5-Aza-CdR处理抑制miR-320a启动子区甲基化后,细胞中miR-320a的表达量增加,并且具有5-Aza-CdR剂量依赖性。3.通过qRT-PCR检测miR-320a在胃癌细胞系中的转染效率。转染miR-320a mimic后胃癌细胞的miR-320a的表达明显升高,转染miR-320a inhibitor后胃癌细胞中miR-320a的表达明显降低,证实转染成功。进而我们通过western blot实验分别检测其可能的靶基因PBX3表达水平的改变。结果提示:miR-320a可以抑制PBX3的表达。通过MTT法检测miR-320a对胃癌细胞增殖活力的影响,结果表明过表达miR-320a后胃癌细胞的增殖活力显著降低。通过流式细胞术检测miR-320a对胃癌细胞凋亡的影响,结果显示与对照组相比,miR-320a过表达后胃癌细胞的凋亡明显增加。Transwell侵袭实验检测miR-320a对胃癌细胞侵袭能力的影响,结果表明miR-320a过表达后,胃癌细胞的侵袭能力明显受到抑制。划痕实验检测miR-320a对胃癌细胞迁移能力的影响,结果表明miR-320a过表达后,胃癌细胞的迁移能力明显受到抑制。miR-320a表达缺失则呈现出相反的结果。4.以胃正常粘膜上皮细胞GES-1为对照,miR-638在胃癌细胞系(SGC-7901,MKN-45,BGC-823,AGS)中的表达水平降低。miR-638在胃癌组织中的表达较对应癌旁组织中的表达水平明显下降,差异明显,有统计学意义(P<0.05)。miR-638的表达与淋巴结转移(P=0.036),脉管浸润(P=0.038),TNM分期(P=0.000),pT分期(P=0.040)密切相关。患者术后无复发中位生存时间为18月,miR-638高表达的病人术后无复发中位生存时间分别为23月,miR-638低表达的病人术后无复发中位生存时间为10月,两组相比较差异显著(Log rank:P<0.05)。5.经MSP法检测胃癌细胞系及胃癌组织中miR-638基因启动子区的甲基化水平。胃癌细胞中miR-638基因启动子区甲基化水平异常升高。104例胃癌组织中,58例呈现基因启动子区高甲基化状态(56%)。miR-638基因启动子区的高甲基化状态与肿瘤的淋巴结转移(P=0.023),肿瘤TNM分期(P=0.001)以及pT分期(P=0.007)显著相关。miR-638低甲基化组的中位生存期为98个月,高甲基化组为45个月,Kaplan-Meier生存分析显示miR-638低甲基化组病人生存期明显长于高甲基化组病人,两组差异具有统计学意义(P=0.003)。6.通过qRT-PCR检测miR-638在胃癌细胞系中的转染效率。转染miR-638mimic后胃癌细胞的miR-638的表达明显升高,转染miR-638 inhibitor后胃癌细胞中miR-638的表达明显降低,证实转染成功。进而我们通过western blot实验检测其可能的靶基因VEGF表达水平的改变。结果提示:miR-638可以明显抑制VEGF蛋白的表达。通过MTT法检测miR-638对胃癌细胞增殖活力的影响,结果表明过表达miR-638后胃癌细胞的增殖活力显著降低。通过流式细胞术检测miR-638对胃癌细胞凋亡的影响,结果显示与对照组相比,miR-638过表达后胃癌细胞的凋亡明显增加。Transwell侵袭实验检测miR-638对胃癌细胞侵袭能力的影响,结果表明miR-638过表达后,胃癌细胞的侵袭能力明显受到抑制。miR-638表达缺失则呈现出相反的结果。结论:1.miR-320a在胃癌细胞系(SGC-7901,MKN-45,BGC-823,AGS)和胃癌组织中表达显著下调。miR-320a表达水平与胃癌患者的肿瘤分化程度,淋巴结转移以及TNM分期显著相关。2.miR-320a在胃癌组织和细胞系中甲基化水平升高,并且与其表达水平下调有关联。抑制miR-320a基因启动子区域的甲基化可以部分恢复胃癌细胞中miR-320a的表达水平。3.高表达miR-320a可以抑制胃癌细胞的增殖,转移和侵袭能力,促进细胞的凋亡。miR-320a为胃癌的癌症抑制因子,对胃癌细胞增殖,侵袭,转移能力的调控可能部分是通过调控其靶基因PBX3来实现的。4.miR-638在胃癌细胞系(SGC-7901,MKN-45,BGC-823,AGS)和胃癌组织中表达显著下调。miR-638表达水平与胃癌患者的脉管浸润,淋巴结转移,TNM分期以及pT分期显著相关。miR-638的表达与患者预后生存率密切相关,miR-638表达水平越高胃癌患者术后平均无复发生存时间越长。5.miR-638的基因启动子区异常高甲基化状态与胃癌细胞中miR-638的表达下调有关联。miR-638的基因启动子区异常高甲基化状态与胃癌患者的淋巴结转移,TNM分期及pT分期显著相关。生存分析显示miR-638低甲基化组病人生存期明显长于高甲基化组病人。6.高表达miR-638可以抑制胃癌细胞的增殖,转移和侵袭能力,促进细胞的凋亡。miR-638为胃癌的癌症抑制因子,对胃癌细胞增殖,侵袭,转移能力的调控可能部分是通过调控其靶基因VEGF来实现的。