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胞苷是核苷酸类保健食品和功能性食品的原料之一,也是合成多种抗病毒、抗肿瘤药物的中间体,主要通过微生物直接发酵法获得。菌体细胞膜对发酵过程中胞苷的分泌有重要影响。本文以解淀粉芽孢杆菌BG-09和大肠杆菌BG-12为研究对象,对细胞膜渗透性相关的基因psd和不同的表面活性剂进行研究,分别分析了同源和异源过量表达psd基因对胞苷发酵的影响,探讨了ps 基因在胞苷分泌过程中的作用;在大肠杆菌BG-12发酵过程中添加4种不同表面活性剂,研究其对胞苷发酵和细胞膜渗透性的影响。主要研究内容的结果如下:1.psd基因过量表达载体的构建。通过途径分析,发现解淀粉芽孢杆菌中磷脂酰丝氨酸脱竣酶(EC:4.1.1.65,由psd基因编码)与菌体细胞膜磷脂合成密切相关。以解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组DNA为模板,扩增psd基因,连接到质粒pHT43中,经酶切验证与电泳分析可知,构建成功,获得重组表达载体pHT43-ppsd。2.过表达psd基因对解淀粉芽孢杆菌BG-09胞苷发酵的影响。将构建的重组表达载体pHT43-psd电转化至Bacillus amyloliquefaciens BG-09 中,获得重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09psd,进行酶基因表达和发酵研究。结果发现,基因psd可以在B.amyloliquefaciens BG-09中表达,在SDS-PAGE电泳中出现正确条带。发酵结果显示,在37℃、200rpm摇瓶发酵条件下,发酵50 h后测得发酵液中的胞苷为0.882 g/L,相比出发菌株B.amyloliquefaciens BG-09的胞苷产量提高了 18.07%,表明psd基因过表达对胞苷发酵有促进作用,能够改变菌体细胞膜的通透性;但是,过表达psd基因对菌体生长有一定的影响,使菌体更早的进入对数生长期较晚进入生长稳定期。3.过表达psd基因对大肠杆菌BG-12胞苷发酵的影响。通过化学转化法将构建的重组表达载体pHT43-psd导入Escherichiacol BG-12中,获得重组菌株E.col BG-12-psd,进行酶基因表达和发酵研究。结果表明,基因psd能够在E.coli BG-12中正确表达,在SDS-PAGE电泳中出现目的条带。发酵结果显示,在37℃、200rpm摇瓶发酵条件下,发酵40 h时测得发酵液中的胞苷产量为0.532 g/L,发酵过程中虽然重组菌的葡萄糖消耗速率较对照菌株有所增加,但发酵液中的胞苷浓度并未增加,仅是对照菌株的89.11%,表明在E.coli BG-12中过表达psd基因对胞苷发酵未产生促进作用,其原因有待进一步研究。4.添加不同表面活性剂对大肠杆菌BG-12胞苷发酵及细胞膜渗透性的影响。在胞苷产生菌E.coli BG-12的发酵过程中添加不同浓度的表面活性剂Tween-80、Triton X-100、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和乙胺丁醇二盐酸盐(EMB),分析菌体生长、耗糖速率和发酵液中胞苷浓度的变化,研究其对胞苷发酵的影响。结果发现,非离子表面活性剂Tween-80添加量对胞苷发酵有明显的影响,添加量在低于5 g/L时,对菌体生长影响不大,耗糖速率呈下降趋势,但发酵液中胞苷浓度增加,在3 g/L时、发酵40 h后,胞苷浓度为1.696 g/L,是对照组的2.42倍;添加质量浓度为0.4～2.0 g/L Triton X-100,均抑制胞苷的产生,浓度大于0.8 g/L时菌株的生长将受到抑制,添加浓度为1.6 g/L发酵40 h时,胞苷产量相对较大为0.362 g/L,是对照组的0.52倍;添加0.4～2 mg/L浓度的CTAB时,对菌株的生长和耗糖速率影响不大,随着浓度增大胞苷的抑制作用加强,当CTAB浓度为0.4mg/L发酵40h时胞苷产量为0.229g/L,是对照组的0.33倍;添加5～25 mg/LEMB时,对菌株生长和耗糖速率影响不大,胞苷产量受到不同程度的抑制,当添加量为5 mg/L时胞苷产量受到的抑制作用最强,发酵40 h时胞苷产量为0.028 g/L,是对照组的0.04倍。结果表明,添加表面活性剂Tween-80可以促进E.col BG-12菌体发酵胞苷的分泌,对细胞膜的渗透性有积极影响,而其他三种表面活性剂均对胞苷发酵无促进作用。因此,在解淀粉芽孢杆菌BG-09中过表达基因psd,可以促进菌体细胞胞苷的分泌,对细胞膜渗透性产生影响,能提高发酵液中胞苷的浓度;而在大肠杆菌BG-12中过表达基因psd时,则对胞苷发酵无积极促进作用。大肠杆菌BG-12发酵过程中添加不同表面活性剂产生不同的效果,Tween-80对胞苷分泌有利,而Triton X-100、CTAB和EMB均对胞苷的分泌无促进作用。