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【目的】建立纯化细胞基质流感疫苗的方法,并从分子水平、蛋白水平及糖基化水平研究MDCK细胞基质与鸡胚基质制备的H1N1病毒HA蛋白生物学特性的差异,系统性评价这些生物学特性的变化对于病毒的免疫原性和疫苗的效果的影响。【方法】采用MDCK悬浮细胞平台技术,分别培养流感病毒H1N1、H3N2、BV及BY,通过多步纯化获得较纯的抗原,制备方式包括低速离心、分子筛纯化、离子交换纯化、广谱核酸酶添加,制备成细胞基质单价H1N1疫苗及细胞基质四价流感疫苗,同时与鸡胚基质制备的单价H1N1疫苗及四价疫苗进行比较研究。进一步处理单价H1N1疫苗,将其去糖基化,制备成去糖基化的细胞基质和鸡胚基质单价H1N1疫苗。通过动物试验比较单价和四价疫苗之间免疫原性差异并对其免疫效果进行评价。同时,通过核酸测序比较两种基质培养的H1N1病毒HA核酸序列的差异;通过质谱检测比较HA蛋白氨基酸序列、糖基化位点和糖基化修饰的差异;通过动物试验比较接种后小鼠血清中细胞因子及脾脏细胞中免疫细胞分化的差异,分析上述生物学特性的差异对疫苗免疫原性的影响。在动物试验中本文还系统性比较了两种疫苗对于不同类型免疫反应的诱导能力,及剂量对于疫苗有效性的影响。【结果】纯化结果显示,该纯化策略适用于四种病毒,病毒液中的宿主蛋白去除率均高于90%,宿主DNA去除率均高于90%,血凝素回收率均高于40%,在一系列纯化后添加广谱核酸酶能进一步去除残留DNA。在生物学特性试验中,两种基质培养的流感病毒HA核酸序列一致;HA蛋白氨基酸组成与理论序列覆盖率均高于94%;鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N103、N178、N303、N497处均发现糖基化,细胞基质制备的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N178、N292、N497处有糖基化,细胞基质培养的病毒在N103和N303处糖基化位点的缺失是由脱酰胺作用造成的;经过糖型分析发现,细胞基质培养的H1N1病毒HA蛋白的糖基化修饰更加复杂,多天线糖基化修饰所占比例更高,鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白中糖基修饰比较单一,主要是高甘露糖及去岩藻糖基聚糖。细胞免疫及天然免疫相关多细胞因子组动物试验结果显示,小鼠在接种细胞基质制备的流感疫苗后的6小时内,血清中MCP-1、IP-10及IL-6浓度显著升高,说明小鼠的天然免疫反应被激活,而鸡胚基质流感疫苗和去糖基化流感疫苗所引起的细胞因子变化无显著性差异,说明HA蛋白上的糖基化是诱导天然免疫的因素之一;体液免疫相关多因子组动物试验结果显示,各组小鼠在接种10天后,血清中的IL-4、IL-5及IL-10浓度无显著性差异,说明不同基质的流感疫苗及去糖基化流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异较小;胞内细胞因子染色试验结果显示不同疫苗组之间B细胞所占比例无显著性差异,进一步说明不同基质流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异不大,而细胞基质流感疫苗能更有效的激活CD8+T细胞的分化,且分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2的T细胞所占比例显著高于其鸡胚基质疫苗和去糖基化流感疫苗组,说明细胞基质流感疫苗可诱导更强的细胞免疫反应,同时也说明糖基化的去除显著降低了疫苗的免疫原性及免疫效果;在体外中和试验中,小鼠在接种第二针疫苗后血清中具有中和活性的抗体显著增加,且细胞基质疫苗组小鼠的血清中和效价显著高于鸡胚基质疫苗和去糖基化疫苗组,但是在血凝抑制试验中,发现鸡胚基质疫苗组的血清保护能力略高于细胞基质流感疫苗组,这两项试验结果的矛盾可能与病毒的培养基质有关;在细胞基质流感疫苗组中比较了低、较低、中、高四个不同剂量,结果显示高剂量组诱导天然免疫、细胞免疫及体液免疫的能力显著强于中、低剂量组,说明增加剂量对细胞基质流感疫苗所产生的免疫保护结果有显著影响。【结论】本课题摸索了一套可应用于工业生产的细胞基质流感疫苗纯化策略,该方法可有效去除宿主蛋白和DNA,且在不添加广谱核酸酶的条件下宿主DNA残留量达到欧洲药典中核酸残留质量标准。在HA蛋白生物学特性的研究中发现其糖基化位点与糖基化修饰会受到培养基质的影响,在细胞基质培养的H1N1病毒中发现了一个独特的糖基化位点N292,但是该位点处于HA蛋白茎部不属于抗原表位区域,且保守性评分较低,说明并可能未处在受体结合区域,所以对于病毒的免疫原性影响仍需进一步确定;同时还发现不同基质培养的H1N1病毒HA上处于受体结合区域的几个糖基化位点的糖基化修饰存在显著差异,因HA蛋白球状头部的糖蛋白在病毒侵染细胞时起关键的识别作用,所以这些位置的糖基化差异有可能导致病毒免疫原性的变化,这说明HA蛋白上的多天线糖基化修饰和更加复杂的糖基化修饰可能是导致流感病毒免疫原性差异的重要原因。同时本研究还发现细胞基质培养的流感病毒在N103和N303处糖基化缺失是由于脱酰胺作用造成,脱酰胺作用能使蛋白质的局部疏水性发生变化,影响蛋白质的空间结构,这与培养基质的pH值、离子种类、离子强度密切相关,说明哺乳动物细胞的细胞内环境可能是造成病毒糖蛋白趋向保守的主要原因。在动物试验中发现糖基化的存在对于疫苗诱导天然免疫和细胞免疫有显著影响,说明HA蛋白的糖基化在诱导机体的天然免疫和细胞免疫时起到一定作用,这可能是因为细胞基质中流感病毒HA糖基化修饰使得病毒更容易被天然免疫和细胞免疫相关细胞识别。体液相关细胞因子的分泌情况与B细胞分化情况说明不同基质制备的流感疫苗的诱导体液免疫能力较为一致,但是动物试验中的体外中和试验结果与血凝抑制试验结果存在矛盾,产生这一现象的原因可能是由于体外中和试验中所用的细胞就是培养流感病毒的MDCK细胞,所以小鼠血清中抗体特异性更强,导致血清的中和效价更高,而血凝抑制所用的材料为鸡血红细胞,在结合鸡胚基质培养的流感病毒时能力更强,导致血凝实验中鸡胚基质疫苗组结果更好,同时上述两项试验结果也说明在检定两种基质流感疫苗时应区分别建立特异性检定方法才能获得更准确的检定结果。