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脑血管疾病是血流供给障碍导致的神经系统疾病,按病变性质分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病,其中缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease, IVCD)即脑卒中,具有很高的发病率和致死率,严重危害人类的健康。脑卒中的病理基础是血栓堵塞血管导致的神经元缺血性死亡,目前治疗常用的方法是溶栓治疗,以恢复缺血组织的血流供给,但血流再灌之后又会导致再灌注损伤,因此脑卒中常常造成缺血/再灌注(ischemia-reperfusion injury, I/R)损伤。脑卒中引起的神经元死亡包括急性缺血型坏死和延滞型凋亡,急性坏死细胞已无法救治,但是延滞型凋亡在合适的治疗时间窗内积极医治很有希望延缓甚至逆转。到目前为止,临床上还没有公认的确切有效的抗脑卒中药物,所以深入研究脑卒中形成的分子机制,形成新的治疗策略和研制开发抗脑卒中新药变得十分迫切。SMND-309是大鼠给予丹参酚酸B后在脑和心发现的一种新化合物,化学结构分析表明SMND-309是丹参酚酸B的降解产物,山东省天然药物工程技术研究中心正在将其开发研制为具有自主知识产权的治疗缺血性脑血管疾病的新药。本文研究了SMND-309对体外脑I/R损伤的保护和治疗作用,同时对其可能的作用机制进行了探讨。1.体外培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),建立氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤模型,模拟体内I/R损伤,同时给予不同剂量(2.5μmol/L、5.0μmol/L和10μmol/L)SMND-309进行保护性干预,SRB法测定SH-SY5Y细胞的相对增殖活力,比色法测定LDH漏出量评价细胞损伤,Hoechst33258荧光染色观察染色质的形态学变化,比色法测定凋亡执行蛋白caspase-3活化度,Western blotting测定凋亡相关蛋白bcl-2和bax含量变化。结果发现,SH-SY5Y细胞经OGD/R之后,细胞增殖活力显著降低(p<0.01),LDH漏出量明显增加(p<0.01),细胞核出现破碎、染色质凝聚、边集等凋亡形态特征,caspase-3活化度显著升高(p<0.01),bcl-2含量明显降低(p<0.01),bax含量变化不明显(p>0.05)；2.5μmol/L、5.0μmol/L和10μmol/LSMND-309分别干预后,明显改善细胞凋亡程度,显著降低LDH活性(p<0.01或p<0.05),提高细胞活力(p<0.01或p<0.05),降低caspase-3活化度(p<0.01),上调抗凋亡蛋白bcl-2含量(p<0.05或p<0.01),未能显著下调bax水平(p>0.05)。2.体外培养SH-SY5Y细胞,全反式维甲酸(ATRA)诱导细胞分化,轻度OGD/R损伤轴突,之后给予SMND-309, SRB法测定细胞增殖活力,选取0.5μmol/LSMND-309进行治疗性试验。测量给药后12 h、24 h和48 h时轴突的长度；Hoechst33258荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染色评价细胞凋亡状态,Rhodamine123染色测线粒体膜电位,Fluro-3/AM染色测细胞内游离[ca2+]浓度,Western blotting测胞内BDNF、t-Akt、p-Akt、t-CREB、p-CREB含量变化。结果发现,ATRA诱导的SH-SY5Y分化型细胞,突起生长明显；轻度的OGD/R之后,轴突回缩,轴突长度缩短明显(p<0.01),分化的细胞没有出现明显的凋亡形态学特征,细胞凋亡率无显著变化(p>0.05),线粒体膜电位显著降低(p<0.05),胞内游离[Ca2+]显著升高(p<0.05)；SMND-309 (0.5μmol/L)治疗性干预后,不同时间点轴突显著增长(p<0.01),细胞凋亡状态稍有改善但调亡率无显著变化(p>0.05),线粒体膜电位显著升高(p<0.01),胞内游离[Ca2+]显著下调(p<0.05)。轻度OGD/R之后,胞内t-Akt、t-CREB含量无显著变化(p>0.05),p-Akt和p-CREB稍有下调(p>0.05)、BDNF水平显著下调(p<0.05)；0.5μmol/LSMND-309干预后,p-Akt、p-CREB、BDNF含量显著上调(p<0.01),LY294002预处理后,SMND-309的作用受到显著抑制(p<0.01)。以上结果显示,SMND-309能抑制OGD/R诱导的神经元凋亡,这种作用与其下调caspase-3活化、上调抗凋亡蛋白bcl-2的表达相关,因此SMND-309具有显著的神经保护作用；SMND-309能提高胞内BDNF的水平,显示出显著的促进OGD/R之后轴突可塑性的功能,这种作用可能是通过PI3K/Akt/CREB信号通路执行。