研究背景乳腺癌(breast cancer)是指发生于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤,是女性常见的肿瘤之一,约占全身恶性肿瘤的7%-10%。全世界每年新发乳腺癌约150万例,死亡约57万例。北美、欧洲等西方发达国家为高发区,其发病率为亚、非、拉地区的4倍左右。我国虽属乳腺癌低发区的国家,但近20年来发病率有增高趋势,特别是在北京、上海、广州等经济发达地区,乳腺癌已成为威胁女性健康的重要危害,有可能超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌的发生是一个复杂的生物学过程,发生机制涉及多基因的突变,包括癌基因激活、抑癌基因失活以及其它相关调节基因的突变,从而使细胞基因组失去稳定性,最终导致肿瘤的发生。又由于女性乳房淋巴管网,回流静脉之间吻合丰富,乳腺癌早期即可发生转移至肺、骨肝、脑等,致使治疗变得更加困难,死亡率大大增加。乳腺癌治疗主要以传统的手术治疗为主,术后辅以局部或全身的放射治疗、化疗及内分泌治疗。近年来,随着分子生物学和分子免疫学研究的迅速进展,以及肿瘤发生基因学说研究的突飞猛进,给乳腺癌的早期诊断带来新的希望。乳腺癌在基因治疗方面的研究包括抑制原癌基因的功能、恢复抑癌基因的功能、基因免疫治疗、自杀基因治疗、多药耐药基因治疗、抗肿瘤血管形成基因治疗、凋亡基因治疗、使用溶瘤病毒等。在对线虫(C. elegans)的研究中取得的令人振奋的发现之一就是鉴定出一类调控发育的微小RNA (microRNA,miRNA)。在1993年,miRNA首次在秀丽隐杆线虫中被发现。现在已知miRNA广泛存在于真核生物细胞内,是最大的基因家族之一,大约占到整个基因组的1%,每个miRNA可以调节上百个基因的表达,而多个miRNAs可能以同一的方式同时作用于一个靶点来下调多种蛋白质表达。在精细调控基因表达及生物生长发育过程方面发挥着重要作用。miRNA是一类长约22nt的非编码功能小RNA,它在许多生物中都有表达。miRNA原初转录本(Pri-miRNA)经过核内和胞质中一系列的加工修饰后形成成熟的miRNA.首先,miRNA基因在RNA polymeraseⅡ作用下,转录生成pri-miRNA;然后在内切酶Drosha作用下,pri-miRNA释放出60-70nt的前体(Pre-miRNA),后者具有不完美的发卡结构；最后,Pre-miRNA在exportin5作用下进入胞质,经DICER切割形成成熟miRNA。成熟的miRNA通过与靶基因3’非翻译区(3’UTR区)形成不完全配对,从而抑制靶基因翻译,或形成接近完全的配对,导致靶mRNA降解。最近发现在人类基因组中,大约有533个miRNA基因座位,数目大约为蛋白编码基因的1%,但可以调控大约1/3的人类基因,说明miRNA是一个调控网络。miRNA在很多生物的生理和病理过程中发挥重要作用,影响细胞发育、凋亡和增殖,并与疾病发生相关。越来越多的证据表明,许多肿瘤的发生与发展与miRNA的异常表达相关,例如乳腺癌、脑癌、慢性粒细胞自血病、结肠癌、肝癌和肺癌等。所以一些miRNAs可能在细胞增殖、分化、凋亡等生物进化过程中起重要作用。Esquela-Kerscher,A等报道,使用miRNAs的基因治疗可能是抑制肿瘤细胞增殖的有效方法。如let-7已被证实可以抑制RAS癌基因,miR-15和miR-16可以抑制BCL2基因活性。人类大多数miRNAs位于mRNA蛋白质编码或非编码内含子区。其他miRNAs可能远离染色体转录区,在mRNA非编码外显子内或者在mRNA3UTRs非编码区,或与其他miRNAs聚集在一起(如在19号染色体上聚集有54个新发现的miRNAs)。miRNA-125b-1就是miRNA其中一员,并且在大多数乳腺癌细胞系表达下降,推测其发挥抑癌作用。Scott, G K等研究发现,miRNA-125b-1可通过靶向作用于HER2和HER3mRNA和蛋白质水平,抑制乳腺癌细胞生长。Hofmann, M (?)等通过MDA-MA-435细胞研究发现,miRNA-125b-1可以靶向作用于c-raf-1mRNA3’UTR区,使得C-Raf蛋白以及下游靶点细胞周期蛋白D1含量下降。Li,W等报道,在乳腺癌细胞系,miRNA-125b-1表达增加可以抑制ERKl/2的磷酸化,减低细胞的转移和侵袭性。并且miRNA-125b-1的靶点有：ras相关蛋白Rab-13(RAB13)、丝苏氨酸蛋白激酶13(AURKC)、酪氨酸蛋白激酶受体Tie-1前体(TIE1)、磷酸肌酸3激酶调节亚基5(PIK3R5)等,这些结果显示,miRNA-125b-1通过蛋白激酶途径抑制细胞增生。在其他方面,Komagata S等,miRNA-125b-1前体在MCF-7细胞中可引起维生素D3羟化酶(CYP24)含量下降,推测癌组织中CYP24高表达与miRNA-125b-1含量下降相关。Smirnov, D A等研究显示,ATM基因通过调节使转录因子CDX2含量增加,后者作用于miRNA-125b-1使其含量下降,而miRNA-125b-1以TNFSF4为作用靶点。ATM-CDX2-(miRNA-125b-1)-TNFSF4信号通路可能是乳腺癌等疾病患病风险增加的调节机制。另外,Iorio,M V等,miRNA-125b-1的靶点有癌基因YES, ETS1、 TEL、 AKT3、生长因子受体FGFR2、丝裂素活化信号转移途径分支：VTS58653,MAP3K10, MAPK14等。在前列腺癌,雄激素可以诱导前列腺癌细胞miRNA-125b-1表达增加,后者可以抑制Bakl(凋亡诱导因子)基因的表达,最终刺激癌细胞的生长。miRNA-125b-1在前列腺癌的发生过程中起癌性作用。而前列腺癌细胞中miRNA-125b-1含量的变化报道不一。在神经系统,在神经胶质瘤细胞系,miRNA-125b-1可以下调细胞周期蛋白CDK6、CDC25A,起到抑制细胞增殖的作用,亦可以靶向作用于DGAT1和SGPL1,并对一些凋亡基因有负性调节,例如可以使BMF(细胞凋亡相关蛋白Bcl-2修复因子)含量下降进而引起Bcl-2表达增加,诱导细胞凋亡。另外,很多学者在探讨miRNAs在阿尔茨海默病以及神经元分化过程中的作用,其中有miRNA-125b-1的参与。如Wu,L等在诱导鼠P19胚胎细胞分化为神经细胞过程中,miR-125a和miRNA-125b-1通过lin-28癌基因的3’非转录区的两个保守反应区,可引起lin-28癌基因表达抑制。在血液系统,miRNA-125b-1在巨噬细胞分化成熟方面起重要作用,例如,Androulidaki,A等,LPS作用于巨噬细胞后,可以通过LPS-(PI3K／AKT)-mi RNAs-TNF来起作用,miRNA-125b-1也参与其中。由此,我们亦可以在乳腺癌细胞系中对此信号通路进行研究。另外,在儿童急性髓细胞性白血病(AML)、小儿急性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)和急性髓性白血病等方面都有学者探讨miRNAs在发病过程中所起的作用。在头颈部鳞癌、未分化甲状腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、泌尿道上皮癌、卵巢癌、子宫内膜异位症、牛皮癣、21三体综合症等方面都有miRNAs(包含miRNA-125b-1)的研究。国内在乳腺癌对于miRNA-125b-1研究很少。沈淑蓉等,使用Realtime RT-PCR方法检测42例乳腺浸润性导管癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中miRNA-125b-1的表达,发现miRNA-125b-1在乳腺浸润性导管癌中表达异常,可能和乳腺癌的侵袭转移等恶性生物学行为有关。c-erbB-2原癌基因,又称HER-2/neu基因,定位于人染色体17q21,编码一种具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的物质p185蛋白,即HER-2/neu蛋白。研究发现P185蛋白与表皮生长因子受体(EGFR)有高度的同源性,它可能与未知配体结合后,通过增加蛋白激酶的活性,促进细胞的分裂、增殖和转化。C-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和p185erbB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。在大多数乳腺癌患者体中,HER-2/neu呈高表达。因此,以HER-2/neu为靶标进行肿瘤治疗已受到广泛关注。在HER-2/neu蛋白质水平上,Genentech公司开发出针对erbB2的抗体herceptin已经被美国FDA批准在临床应用,对erbB2过表达的肿瘤具有很好的治疗效果,herceptin单药对转移性乳腺癌的有效率约15％, herceptin能诱导erbB2过表达的乳腺癌SKBR3细胞停止于G0/Gl期,对SKBR3细胞增殖抑制率达63%。Herceptin被证实具有拮抗生长信号系统、趋化免疫细胞以攻击肿瘤细胞及增强化疗诱导的细胞毒等作用因此,erbB2受体已成为一个新的抗肿瘤靶点。在HER-2/neu基因水平,有人通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)基因阻断技术,有人通过癌基因反义寡脱氧核苷酸技术,都能诱导乳腺癌细胞SKBR-3的凋亡,细胞活力减低,使p185蛋白表达降低。但对miRNA-125b-1作用于HER-2/neu癌基因的研究非常少。传统抗ErbB2单克隆抗体herceptin与ErbB2受体胞外结合域进行特异结合,抑制ErbB2同源二聚化,达到阻断下游信号传导的目的。但这种方法对于缺乏细胞外配体结合域的受体(P95ErbB2)以及ErbB2异源二聚体(ErbB2/ErbB3、ErBl/ErbB2、 ErBI/ErbB3)无效。而miRNA-125b-1可与c-erbB-2癌基因mRNA3’ UTR区特异性结合,在转录和翻译水平抑制ERBB2.本研究通过使用miRNA-125b-1作用于SKBR-3细胞(Her2阳性),来探讨miRNA-125b-1对Her2基因表达及对细胞放化疗敏感性的影响。全新的作用机制决定了miRNA-125b-1更能从mRNA水平阻断ErbB2受体信号传到通路,达到抑制肿瘤细胞的作用。这为我们对ErbB2阳性的乳腺癌的治疗提供了新方法。本研究拟合成miRNA-125b-1,利用脂质体将miRNA-125b-1导入乳腺癌SKBR-3细胞中,抑制或封闭ErbB2基因的表达,从而达到抑制肿瘤的生长、增值、分化和诱导其凋亡的目的。同时检测miRNA-125b-1是否能够提高乳腺癌对放疗的敏感性。另外,miRNA-125b-1具有增强化疗效果的作用,应用针对Her2的miRNA-125b-1,同时应用紫杉醇等化疗药物,检测是否能够提高乳腺癌对紫杉醇等化疗药物的敏感性。这种肿瘤治疗方法把小干扰RNA同放化疗进行了完美的结合,具有极大的临床研究价值。对miRNA-125b-1应用于Her2阳性的乳腺肿瘤提供了理论基础,也为应用于其他实体肿瘤的治疗提供重要的参考价值。目的探讨miRNA-125b-1对乳腺癌SKBR-3细胞放化疗敏感性的影响,及其对靶基因HER-2蛋白表达的影响。方法合成miRNA-125b-1并通过lipofectamineTM2000转染SKBR-3细胞,分别用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western Blot法检测IER-2mRNA和蛋白质表达水平的变化；流式细胞仪检测细胞周期；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测细胞增殖抑制率；经不同剂量X线照射后,平板克隆形成实验计算细胞存活率,用单击多靶数学模型进行曲线拟合作图,求曲线参数D0、Dq和N。值,比较细胞放射敏感性的变化。MTT法观察miRNA-125b-1-1对紫杉醇作用于SKBR-3细胞增殖的抑制情况。应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示,使用Shapiro Wilk法进行正态分布检验,P>0.05为满足正态分布；使用Leven’test进行方差齐性检验,P>O.05为满足方差齐性；在方差不齐时,选择近似F检验Welch法方差分析。对细胞周期实验结果做秩和检验后再调整检验水准做两两比较；细胞增殖实验结果使用Mauchly’s test of sepericity进行球形检验,球形检验统计量P>O.05不拒绝球形假设,并采用重复测量方差分析；RT-PCR和Western blot定量结果采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果miRNA-125b-1转染后的SKBR-3细胞中HER-2mRNA (F=447.779, P=0.000)和蛋白质水平显著下降(F=10.073,P=0.012)；转染后的SKBR-3细胞出现了G2M期阻滞；miRNA-125b-1组细胞增殖抑制率与阴性对照组相比,差异有显著性(F=139.590,P=0.000)；曲线拟合后显示,转染后的细胞(D0=1.866, Dq=2.681, N=4.207)与对照组(D0=2.513, Dq=4.097, N=5.107)相比D0,Dq和N值均下降(SER=1.347),提示细胞放射敏感性增加。用miRNA-125b-1处理组细胞的IC50与未处理组相比下降2.69倍(P<0.05),由此表明,miRNA-125b-1可增加乳腺癌SKBR-3细胞对紫杉醇的敏感性。结论miRNA-125b-1可使乳腺癌SKBR-3细胞的放射敏感性增加,miRNA-125b-1可增强乳腺癌SKBR-3细胞对紫杉醇的化疗敏感性。为HER-2阳性的乳腺癌提供新的治疗方法。