乳腺癌是由乳腺上皮细胞发生癌变而产生的恶性肿瘤,也是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一。近年来随着社会和环境等诸多因素的改变,导致乳腺癌的发病率迅速增长。尽管目前基于新的肿瘤靶标的靶向治疗在乳腺癌的治疗中发挥了十分重要的作用,但是由于乳腺癌术后的远端复发和转移性,导致了部分乳腺癌患者预后仍然不理想。因此,寻找乳腺癌治疗的靶标和预后标志物,探讨关键分子对乳腺癌发病的调控机制,研发特异性靶向治疗制剂,是近年来乳腺癌转化研究领域的重点和难点。类表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）是由53个氨基酸残基组成的多肽链。它的结构特点是由空间上相互交错的半胱氨酸组成3个二硫键。这些二硫键是保留EGF生物活性的重要结构。EGFL6属于EGF域超家族成员,由Yeung于1999年首先发现并证实其定位于人Xp22染色体上。由于EGFL6同时具有EGF结构域和MAM结构域,所以又被命名为MAEG。EGF域家族蛋白在参与调控细胞周期、细胞粘附、细胞增殖、细胞迁移和神经发育的过程中起着非常重要的作用。业已研究发现,口腔鳞状细胞癌患者血浆中EGFL6的高表达与临床病理特征有关;EGFL6高表达在例如黑色素瘤、肺癌等一些特定肿瘤组织中,尤其是卵巢癌肿瘤内皮细胞。最近Cancer Research上的一篇文章阐述了 EGFL6能够促进卵巢癌细胞增殖和迁移,同时利用EGFL6阻断型抗体干预荷瘤动物可以降低卵巢癌细胞的生长和迁移。这一发现对于高危卵巢癌病人的治疗具有潜在的意义。已有研究表明,EGF可通过诱导EMT促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。那么EGFL6是否通过诱导EMT介导乳腺癌细胞的恶性生物学行为尚须进一步探讨。上皮细胞到间质细胞的转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）这一过程目前被认为是癌变及转移的重要环节。上皮细胞来源的癌变占据了全部恶性肿瘤发病率的90%以上,其转移是肿瘤致死的主要原因之一。常见的肿瘤转移有肝转移、肺转移和骨转移。肿瘤细胞的转移特性严重的影响了器官的功能,进而威胁到了患者生命。同时,癌细胞无限的扩增,破坏正常的细胞组织并抑制凋亡的发生,也给癌症的治疗带来了众多的困难。在EMT启动肿瘤细胞侵袭转移的过程中,肿瘤细胞获得了类似肿瘤干细胞自我更新的特性,具有干性的细胞在肿瘤的形成和发展中也起着重要的作用。在人的乳腺肿瘤中,有一群肿瘤细胞亚群以CD44high/CD24low的抗原表型存在。过表达Snai1、Twist和TGF-β等将会增加肿瘤球体的产生,并增加干细胞标志CD44high/CD24low的产生。这一证据表明,EMT与肿瘤干细胞的增加可能有直接联系,这可能是癌细胞转移的先决条件。更好的认识乳腺癌的发病及进展的分子机制,挖掘乳腺癌生长和转移侵袭过程中的关键分子,对于开发针对转移复发性乳腺癌患者的抗体来说尤为重要。抗体治疗是肿瘤生物治疗的一个非常重要的方向。抗体杀伤肿瘤细胞的主要机制是阻断肿瘤细胞的生长,激活凋亡通路的信号传导,并且活化免疫系统介导对肿瘤的杀伤。近些年来,随着肿瘤发病机制逐渐被发现,有针对性的利用抗体进行治疗在临床上取得了显著的疗效。由于抗体具有高度的靶向特异性,因此研究癌症发病的分子生物学机制,发现诱发癌变的关键分子,研制这些特异性的分子治疗性抗体,将会为乳腺癌免疫治疗开拓新的途径。由于EGFL6在肿瘤细胞中的高表达可能与癌症的发生和发展有相关性,EGFL6极有可能成为癌症诊断和治疗的新靶标。因此,深入研究EGFL6在乳腺癌中的作用及机制,具有重要的价值,同时为靶向EGFL6的单克隆抗体用于乳腺癌的治疗开拓新的途径。本课题利用多种特征性乳腺癌细胞模型和肿瘤模型系统,分析EGFL6表达沉默或过表达对乳腺癌生长的促进和迁移作用,通过体内外多个层面的实验研究,揭示EGFL6对乳腺癌细胞增殖及迁移的调控及其分子机制。此外,研发了特异性抗人EGFL6单克隆抗体,利用抗体在体外对乳腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖进行干预,继而采用小鼠荷瘤模型探讨这两株抗体的干预对肿瘤的生长作用,旨在为进一步开发EGFL6靶向抗体干预乳腺肿瘤提供临床应用价值。第一部分表皮生长因子样结构域蛋白-6对乳腺癌细胞恶性生物学行为的调控作用[目的]检测膜型和可溶性EGFL6在乳腺癌细胞株中的表达,在乳腺癌细胞中过表达或沉默表达EGFL6,分析EGFL6对乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用和机制。[方法]（1）采用qPCR和Western blot方法分析6株乳腺癌细胞株中EGFL6 mRNA和蛋白的表达,采用ELISA方法检测乳腺癌细胞上清中可溶性EGFL6的表达;（2）构建过表达EGFL6的质粒pLVX-Puro-EGFL6和对照质粒pLVX-Puro-Control,建立稳定过表达EGFL6细胞系MCF-7/EGFL6和下调EGFL6表达的细胞系 T47D/shRNA 和 MDA-MB-231/shRNA;（3）采用 Transwell 迁移侵袭实验和细胞划痕实验检测EGFL6的表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响。利用外源加入的人重组蛋白EGFL6和过表达EGFL6的条件培养基验证其对乳腺癌细胞迁移的影响;（4）采用qPCR、Western blot和细胞免疫荧光染色检测EGFL6表达变化后,乳腺癌细胞中 EMT 相关标志物 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronection 和相关转录因子的表达情况;（5）采用Alamarblue、平板克隆和3D培养实验,检测EGFL6表达调节对乳腺癌细胞增殖的影响。通过qPCR检测凋亡相关分纛Bcl-2、Fas和Caspase3的变化。通过Annexin V细胞凋亡试剂盒检测EGFL6对乳腺癌细胞凋亡的作用;（6）采用流式细胞术和qPCR检测乳腺癌细胞EGFL6表达改变后,CD24-/CD44+细胞的群体数量以及肿瘤干细胞标志物的变化;（7）选取EGFL6稳定上调表达的乳腺癌细胞MCF-7/EGFL6及相应的对照细胞MCF-7/NC构建裸鼠皮下移植瘤模型,定期检测裸鼠体内肿瘤生长情况。采用冰冻切片免疫组化染色方法检测小鼠肿瘤组织中EGFL6与CD31的表达。Western blot检测裸鼠移植瘤组织中AKT和ERK磷酸化水平的变化。[结果]（1）通过qPCR和Western blot发现6株乳腺癌细胞表面均存在不同程度膜型EGFL6的表达。其中EGFL6在T47D细胞表达最高而在MCF-7表达最低。EGFL6结合试验也表明EGFL6可以与乳腺癌细胞结合并在肿瘤生长中发挥潜在作用。ELISA结果显示,可溶性EGFL6高表达于乳腺癌细胞株T47D和人内皮细胞RF24中;（2）建立了过表达EGFL6的乳腺癌细胞系MCF-7/EGFL6和稳定沉默表达 EGFL6 的乳腺癌细胞株 T47D/shEGFL6、MDA-MB-231/shEGFL6;（3）EGFL6表达上调促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。外源加入的人重组蛋白EGFL6和过表达EGFL6的条件培养基刺激下,同样可以提高乳腺癌细胞的迁移和侵袭;（4）EGFL6表达上调后,MCF-7细胞发生EMT改变,E-cadherin表达降低,N-cadherin和Vimentin表达升高。而EGFL6表达下调后T47D和MDA-MB-231细胞中E-cadherin表达升高,N-cadherin和Vimentin表达降低;（5）EGFL6表达升高后,乳腺癌细胞活力和平板克隆形成数目较对照组均明显升高,3D培养成球实验细胞直径大于对照组,EGFL6表达下调后,乳腺癌细胞的上述生物学行为较对照组明显受到抑制。EGFL6表达降低后,细胞凋亡水平增高,Fas和Caspase3表达明显上调,而Bcl-2的表达明显下调;（6）流式细胞术结果显示,EGFL6表达降低后,CD2C/CD44+细胞群体减少。qPCR结果显示,EGFL6表达降低后,作为肿瘤干细胞标志物或参与自我更新的分子例如ITGB1、BMI1、ITAG6、ALCAM、CD44、FGFR2、DNMT1、KLF4、MYC表达下调,磷酸化AK1T和ERK的水平显著下调;（7）荷瘤裸鼠模型结果显示,过表达EGFL6的MCF-7细胞的成瘤体积和质量较对照组明显升高。移植瘤冰冻切片免疫组化结果显示,与对照组相比,EGFL6表达增高后,CD31的表达水平也明显提高,磷酸化AKT和ERK的水平显著增高。[结论]EGFL6表达上调可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力,诱导乳腺癌细胞发生上皮间质转化,维持肿瘤细胞的干性。EGFL6表达上调可促进乳腺癌细胞的增殖和体内成瘤能力,并抑制细胞凋亡,促进肿瘤组织的血管生成。提示EGFL6在乳腺癌的进展与迁移中发挥重要作用,可初步确认EGFL6是乳腺癌治疗的新靶标。为制备EGFL6单克隆抗体抑制乳腺癌的增殖与迁移的研究提供有力的依据。第二部分抗人EGFL6单克隆抗体靶向治疗对人乳腺癌细胞株及皮下移植瘤生物学属性的抑制作用及相关信号通路的初步探讨[目的]研制EGFL6单克隆抗体,体外实验研究其对人乳腺癌细胞株的增殖、迁移和侵袭的抑制作用,体内实验研究该抗体对乳腺肿瘤组织生长的作用,初步探讨EGFL6单克隆抗体用于治疗乳腺癌的作用和机制。[方法]（1）为获得靶向EGFL6的单克隆抗体,采用人EGFL6蛋白定期免疫实验兔子获取外周血单个核细胞,分离记忆性B细胞,用ELISA法筛选得到EGFL6抗体;（2）采用Transwell迁移侵袭实验和细胞划痕实验检测EGFL6抗体对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用;（3）采用Alamar blue实验检测EGFL6抗体对乳腺癌细胞增殖的抑制作用;小鼠IgG作为平行对照;（4）采用Western blot方法检测EGFL6抗体对下游信号通路的改变;（5）采用异种移植小鼠模型验证EGFL6体内潜在的治疗应用价值。选取乳腺癌细胞系T47D和MCF-7/NC及过表达EGFL6的MCF-7/EGFL6细胞接种于裸鼠,从接种后的第7天起定期用EGFL6单克隆抗体对荷瘤裸鼠进行治疗并定期对小鼠进行肿瘤体积的检测,小鼠IgG作为平行对照;（6）用Western blot方法检测人乳腺癌皮下荷瘤鼠经过EGFL6单克隆抗体治疗后肿瘤组织内相关信号通路关键分子的表达变化;（7）运用冰冻免疫组织化学方法检测单克隆抗体治疗后肿瘤组织内EGFL6与CD31表达的相关性。[结果]（1）得到两株功能性单克隆抗体#93和#135,两株抗体识别于EGFL6的不同位点。其中#93识别EGF结构域,而#135识别RGD和MAM结构域,可用于体外和体内研究治疗;（2）与小鼠IgG平行对照组比较,体外实验中EGFL6抗体治疗组细胞迁移和侵袭能力明显降低。同时RF24/EGFL6条件培养基刺激T47D/shEGFL6和MDA-MB-231细胞迁移的情况在EGFL6抗体治疗下可逆转。划痕实验与Transwell结果一致,即抗体治疗降低了内源或外源过表达EGFL6的T47D和MDA-MB-231细胞划痕覆盖率;（3）EGFL6抗体治疗后,可抑制乳腺癌细胞增殖。T47D和MCF-7细胞在加入RF24/EGFL6条件培养基后,细胞活力的增加也可以通过加入EGFL6抗体而得到抑制;（4）EGFL6抗体可抑制乳腺癌细胞AKT和ERK的磷酸化水平及EMT标志物E-cadherin和Vimentin蛋白水平;（5）EGFL6抗体治疗能够抑制MCF-7/EGFL6和T47D肿瘤生长;（6）小鼠肿瘤样本显示,抗体治疗阻断了 AKT和ERK信号,从而抑制细胞移植瘤生长。与IgG平行对照组比较,冰冻切片免疫组化结果显示,肿瘤组织切片中CD31的表达随EGFL6抗体治疗而降低。[结论]研制了两株识别不同位点的抗EGFL6抗体,可用于体内外实验。体外实验结果显示,抗EGFL6单克隆抗体可以抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力;体内实验结果显示,EGFL6单克隆抗体干预后,可以显著抑制小鼠体内移植瘤体积和质量,抑制肿瘤组织血管的生成。初步证明EGFL6的抗肿瘤活性与下游信号通路PI3K/AKT和MAPK/ERK有关,为EGFL6治疗性抗体的应用提供了有价值的理论基础。综上所述,本课题通过体内外多个层面和不同水平的实验证实EGFL6与乳腺癌的生长和迁移密切相关,本文发现EGFL6通过EMT机制加速乳腺癌细胞发生间质化转变,促进肿瘤的进展;乳腺癌EGFL6表达上调可以促进pAKT和pERK信号及相应生物学功能;研制了两株兔抗人EGFL6的特异性抗体可以有效的阻断乳腺癌细胞的增殖迁移及乳腺癌肿瘤组织的生长。进而阐明了 EGFL6调控乳腺癌进程及促进肿瘤生长与转移的作用机制,为乳腺癌免疫干预提供一个新的靶点。