研究背景和目的:胃癌,是目前主要恶性肿瘤之一,虽然近年来我国在胃癌防治工作中取得了很大进步,治疗效果也已经发生了巨大的变化,但是5年的生存率仍然很低,究其原因还是因为对胃癌发生发展的具体机制不清楚。胃癌干细胞是一些具有干细胞特性的细胞,与肿瘤恶性程度、耐药及转移高度相关。SPOP基因是一种高度保守性的基因,其缺失可能引起肿瘤的发生和发展,前期研究已经发现SPOP在很多实体肿瘤中扮演着重要的角色,但是在胃癌干细胞中的地位及作用目前仍然不清。众所周知,蛋白表达过程有多种机制参与其中,而miRNA在肿瘤的发生和发展进程中可以通过对细胞增殖、分化、凋亡的调控起作用。但具体是通过何种途径调控细胞,也不是很清楚。本研究目的在于探讨SPOP在胃癌中的表达和功能,以及miRNA-543对其的靶向调控的相关途径,为胃癌的治疗提供一些新的思路。研究方法:1、对胃癌细胞株MKN-45运用悬浮培养法培养胃癌干细胞并予以分离,采用免疫荧光、Western blot对干细胞标记物鉴定并进行动物实验检测胃癌干细胞的成瘤能力。2、分别使用Western blot及实时定量PCR对胃癌及癌旁正常组织中SPOP的表达进行检测。3、分析胃癌组织SPOP的表达与临床病理特征等因素的关系。4、检测SPOP在胃癌细胞株MKN-45球体细胞与贴壁细胞中的表达。5、通过将SPOP过表达慢病毒转染球体细胞,使用Western blot检测过表达SPOP在肿瘤干细胞的标记物（Oct3/4、Sox2和CD44）表达情况,以及相应的成球能力。6、通过将过表达SPOP的球体细胞和对照的球体细胞分别接种于裸鼠,观察成瘤情况。7、选取了 36对胃癌及癌旁组织使用实时定量PCR检测miRNA-543及SPOP的表达情况,然后采用Spearman相关系数分析进行数据统计分析,得出胃癌组织中miRNA-543与SPOP的表达水平的相关性。8、通过荧光素酶报告基因实验证实SPOP是否在胃癌中是miRNA-543直接的靶点。9、通过实时定量PCR及Western blot分析,转染了 miRNA-543 mimic的MKN-45和AGS相比于对照组,miRNA-543及SPOP mRNA和蛋白的表达情况;以及转染了 miRNA-543 inhibitor 的 MKN-45 和 AGS 相比于对照组,miRNA-543 及SPOP mRNA和蛋白的表达情况。10、通过转染 miRNA-543 mimic、miRNA-543 inhibitor 以及 miRNA-543 inhibitor+SPOP siRNA后,观察细胞迁移和侵袭情况。11、通过 Western blot 检测转染了 miRNA-543 mimic、miRNA-543 inhibitor 后的MKN45和AGS细胞中SPOP、E-cadherin及vimentin蛋白的表达水平,说明EMT在此过程中起到的作用。研究结果:1、成功培养并分离出的悬浮球体细胞,随着时间的推移,球体细胞逐渐增多,球体不断增大。2、分别使用免疫荧光、Western blot分析悬浮球体细胞与贴壁细胞干细胞标记物CD44、Sox2和Oct3/4的表达差异。发现悬浮球体细胞具有肿瘤干细胞特性,并且其成球能力、干细胞标志物的表达等均比贴壁细胞显著增高,致瘤能力也较贴壁细胞显著增强。3、分别使用Western blot及实时定量PCR对胃癌及癌旁正常组织SPOP的表达进行检测,结果显示,胃癌组织SPOP蛋白、SPOP mRNA表达水平显著低于其对应癌旁组织,起到抑癌基因的作用。4、分析60例胃癌组织SPOP表达与临床病理特征的关系,发现胃癌组织SPOP的表达与肿瘤TNM分期（P=0.038）、分化程度（P=0.029）、浸润深度（P=0.009）、淋巴结转移（P=0.001）有关,差异具有显著统计学意义,与患者的性别、年龄、肿瘤大小及是否存在远处转移无明显相关性。对SPOP表达、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、性别、年龄、肿瘤部位及分化程度等临床病理参数与胃癌患者生存期分别进行Cox回归单因素分析,结果显示SPOP表达（P<0.001）、TNM分期（P<0.001）、浸润深度（P=0.007）、淋巴结转移（P=0.034）及分化程度（P=0.041）是影响胃癌患者生存时间的因素,差异均有统计学意义。将上述影响胃癌患者生存时间有意义的因素导入Cox 比例风险模型分析,发现SPOP表达（P=0.002）、TNM分期（P=0.018）及分化程度（P=0.010）是影响胃癌生存时间的独立因素。采用Kaplan-Meier法分析SPOP表达与胃癌患者生存时间的关系,分析结果显示SPOP高表达患者与低表达患者生存时间有显著差异,高表达组患者的5年生存率高于低表达组,差异有统计学意义（P=0.036）。5、我们通过将SPOP过表达慢病毒转染球体细胞,即在新鲜培养液中加入SPOP过表达慢病毒的转染球体细胞,以空载慢病毒处理的球体细胞作为对照,14天后观察比较转染SPOP后球体细胞形成子代球体的情况,并计算两组细胞的克隆球形成率。结果显示SPOP蛋白在胃癌干细胞中的表达明显低于贴壁细胞（P<0.05）,SPOP mRNA在胃癌干细胞中的表达也明显低于贴壁细胞（P<0.05）。6、通过将SPOP过表达慢病毒转染球体细胞,发现过表达SPOP能显著抑制肿瘤干细胞标记物（Oct3/4、Sox2和CD44）的表达,而且成球率也被显著抑制了。将过表达SPOP的球体细胞和对照的球体细胞分别接种于裸鼠,可见过表达SPOP能显著抑制肿瘤生长（P<0.05）。7、我们选取了 36对胃癌组织及胃癌癌旁组织使用实时定量PCR检测miRNA-543及SPOP的表达情况,miRNA-543在癌组织中的表达要强于癌旁组织（P<0.001）。SPOP mRNA则在癌组织中的表达则前一致（P<0.001）。并采用Spearman相关系数进行数据统计分析,得出胃癌组织中miRNA-543与SPOP的表达水平呈负相关（P<0.001）。8、通过荧光素酶报告基因实验证实SPOP是胃癌中miRNA-543直接的靶点。9、通过 qPCR 及 Western blot,在 MKN-45 及 AGS 细胞中转染了 miRNA-543 mimic可显著减少SPOP mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,转染miRNA-543 inhibitor后,MKN-45和AGS细胞的SPOP mRNA和SPOP蛋白水平均显著上升。（P<0.05）。10、通过转染miRNA-543 mimic及inhibior,可得出miRNA-543对胃癌细胞迁移和侵袭产生影响。并通过Western blot分析显示转染miRNA-543 mimic的细胞中SPOP和E-钙黏蛋白的表达减少,波形蛋白水平上调,转染miRNA-543 inhibitor结果相反。因此表明miRNA-543诱导胃癌细胞EMT。研究结论:1、通过悬浮培养法培养出的球体细胞,具有肿瘤干细胞的特性,有比贴壁细胞更强的成瘤能力。2、SPOP在胃癌中是抑癌基因,且在胃癌球体细胞中表达比贴壁细胞更明显。SPOP可以作为胃癌生存时间的独立因素。3、miRNA-543在胃癌中起促进作用,呈负相关靶向调控SPOP,且经证实EMT在其调控过程中起重要作用。