近年来,犬类动物在人类的生活中越来越占据重要的部分,如作为伴侣动物、警犬、救护犬等。但各种病毒性疾病困扰着中国的养犬业,一方面对于病毒学传染病,目前还没有发现一种特效治疗药品,且由于各种原因,有的病毒致病性毒力增强;另一方面,由于疫苗在使用、保存等方面原因,造成免疫程序失败。狂犬病,犬细小病毒病等在人们的生活中重复的发生给人们带来了不小的危害,有些病毒是人畜共患病的病原,已经引起全社会的关注。因此,从兽医和人医临床角度出发,综合控制犬病毒性疾病,需要安全、有效、副作用少的药物产生,而犬干扰素就具有很高临床运用价值,而研究有关犬干扰素的生物制品势在必行。犬的α干扰素具有广谱的抗病毒作用,有很高的研究应用价值,因此本课题研究了犬的α干扰素,并对其基因进行了改造,在不同的表达系统中进行了表达和生物活性测定。具体的研究有以下几个方面: 1,以经刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,再通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素成熟蛋白的全基因,将此基因克隆于原核表达载体pBV220,并将重组表达载体转入几种不同的大肠杆菌中进行温敏诱导表达,有的不能获得明显表达,只在改造过的大肠杆菌中获得高效表达。通过分析发现是犬α干扰素基因中含有16%之多的大肠杆菌的稀有密码子导致了基因的表达翻译障碍。表达产物经SDS-PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa。将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞、牛肾细胞上用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN-α具有较高的抗病毒作用,生物活性最高时达到5.11×10~6U/mg。 2,为了获得具有天然结构的重组犬α干扰素,本研究把犬α干扰素的成熟蛋白基因的5’端进行了改造后,把它克隆到具有分泌信号肽基因片段的酵母表达载体上,电转化入巴斯德毕赤酵母X-33中,将诱导表达的培养基上清收集进行简单纯化后,经SDS-PAGE分析,表达的蛋白比原核表达系统的表达产物大几kDa,分析其原因,是由于基因序列中有两个潜在的糖基化位点,酵母的表达产物被加工糖基化了,或者还有其他的蛋白质的加工修饰过程。也将酵母表达的重组犬α干扰素在犬肾细胞、牛肾细胞上进行多次活性测定,活性为1.61-6.51×10~6U/mg。 通过本研究可以得出:大肠杆菌表达的干扰素具有表达产量高的优点,但其试验操作复杂、繁琐,时间长,在向生产转化的过程中需要较高的专业技术。用酵母系统表达的干扰素更接近于天然的蛋白质结构,方法简单易于操作,生产技术和生产设备