论文部分内容阅读
目的:通过Hulth方法建立兔膝关节骨关节炎(KOA)动物模型,观察富血小板血浆(PRP)对兔KOA动物模型关节软骨组织形态和显微结构的改变,关节软骨中Ⅱ型胶原、蛋白多糖、MMP-13及m RNA表达情况,初步分析PRP对KOA退变软骨的影响,探讨PRP治疗KOA的可能作用机理,为PRP在临床应用提供理论依据。方法:取成年清洁级新西兰大白兔32只,雄性,体重2.25±0.20kg;随机分为四组:A组:空白对照组;B组:模型对照组;C组:PRP治疗组;D组:玻璃酸钠治疗组。适应性喂养一周后,A组行模拟造模,B、C、D组按Hulth方法诱发建立兔KOA动物模型。动物模型建立成功后,C组予PRP0.5mL关节腔注射治疗,3周1次,共2次;D组予玻璃酸钠注射液关节腔注射,每周1次,连续5周;A、B组于C组同一时间点给予等量无菌生理盐水注射。6周后处死实验动物,观测各试验指标。(1)观察关节软骨的大体外观形态变化并进行评分,比较各组间大体外观形态变化。(2)观察关节软骨的组织结构、细胞数量、潮线的完整性和甲苯胺蓝染色等情况,比较各组间Mankin’s评分的差异。(3)用免疫组化法测定各组关节软骨组织中Ⅱ型胶原和蛋白多糖(GAG)的表达情况,比较各组间的差异。(4)应用RT-PCR技术对关节软骨细胞中MMP-13m RNA表达情况进行检测;应用western blot蛋白印迹法检测关节软骨中的MMP-13表达情况,比较各组间的差异。结果:(1)关节软骨的大体外观形态比较:A组正常关节软骨外观;B组关节如软骨损伤最重;C、D组关节软骨有退变但与A组接近。参照关节软骨大体观察评分标准评分结果:A组评分最低,B组评分最高,C、D组评分明显低于B组。A组与B组比较,差异有统计学意义(P<0.01);B组与C、D组评分比较,差异有统计学意义(P<0.01)。C组与D组评分比较,差异无明显统计学意义(P>0.05)。(2)关节软骨光镜下观察结果:A组关节软骨结构形态正常;B组软骨结构改变较大。C、D组软骨形态结构虽有改变,但与A组软骨结构较接近。细胞数量、潮线及甲苯胺蓝染色Mankin’s评分结果:A组评分最低,B组评分最高,C、D组经治疗后评分明显降低。A组评分与B组比较,差异有统计学意义(P<0.01);B组评分与C、D组比较,差异有统计学意义(P<0.01);C组评分与D组比较,差异无明显统计学意义(P>0.05)。(3)Ⅱ型胶原和GAG测定结果:B组Ⅱ型胶原和GAG阳性染色积分光密度(IOD)均值较A组明显降低,C、D组Ⅱ型胶原和GAG阳性染色IOD均值与A组较接近。A组Ⅱ型胶原和GAG阳性染色IOD均值与B组比较,差异有统计学意义(P<0.01);B组Ⅱ型胶原和GAG阳性染色IOD均值与C、D组比较,差异有统计学意义(P<0.05);C组Ⅱ型胶原和GAG阳性染色IOD均值与D组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)关节软骨细胞中MMP-13及m RNA表达情况结果:MMP-13蛋白及其m RNA表达均值A组最低,B组最高,C、D两组介于二者之间。A组MMP-13及m RNA表达均值与B组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);B组MMP-13及m RNA表达均值与C、D两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);C、D两组治疗后MMP-13m RNA表达均值比较,差异无统计学意义(P>0.05);C、D两组治疗后MMP-13的蛋白表达均值比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)Hulth方法诱发建立的兔KOA动物模型,成功率高,稳定性好。(2)采用Landesberg法制备PRP,获得的PRP浓度较稳定,与多数文献报道的结果吻合,操作方法简单。(3)PRP能促进中期退变软骨的修复,减轻软骨的磨损,延缓KOA关节软骨退变病变进程。(4)PRP可促进关节软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成,有促进关节软骨细胞再生和软骨基质修复的作用。(5)PRP能抑制关节软骨组织MMP-13蛋白及其m RNA表达,有效地防止基质胶原的降解,减缓骨性关节炎的病变进程,有保护关节软骨、抑制关节软骨被破坏的作用。