目的：成年机体中骨骼仍处于不断更新和改建的动态过程。骨组织是骨骼的主要构成成分,组成骨组织的成骨细胞不断形成新骨,破骨细胞不断吸收旧骨。通过成骨细胞和破骨细胞之间相互偶联和精确调节使骨形成和骨吸收保持骨稳态。当骨稳态受到破坏后会导致许多骨骼疾病的发生。由于维持骨稳态的成骨细胞和破骨细胞主要来源于BMSCs、HSCs以及骨相关前体(干)细胞,所以在骨发育、衰老、增龄和再生修复中干细胞起到了主导作用,同时干细胞的各项功能受到旁分泌、自分泌细胞因子及多种激素和信号通路调控,这些调控因素不仅是维持骨生理性功能活动的基础,而且是决定骨骼病理状态产生、发展和转归的机制。Apert综合征(Apert syndrome, AS)是临床最严重的人类颅缝早闭。主要是冠状缝发生早闭,典型的外观特征是短头畸形、颜面发育不良伴严重的并指(Syndactyly)。前期研究证实,Apert综合征主要由FGFR2的两种功能增强型(Gain-of-function)点突变(Ser252Trp、Pro253Arg)引起。由于患者的遗传背景差异较大,缺乏同年龄、有类似遗传背景的正常人群作对照,和其它人类疾病研究一样,Apert综合征的研究长期以来主要局限于临床病例的报道及对有关体征的临床分析,缺乏对Apert综合征的发病分子机制和FGFR2突变导致骨骼异常发育中与其它信号通路的协同作用。Chen等(2003年)和Wang等(2005年)两个研究小组利用基因敲入技术建立了FGFR2 S252W功能获得性突变小鼠模型,也被称为Fgfr2S252W/+小鼠。该小鼠模型呈现出与人类Apert综合征相似的头颅表型特征,说明可将它们用于从整体动物或组织、细胞水平研究Apert综合征发病机制、相关基因之间的相互作用和调控机制。虽然利用Fgfr2S252W/+小鼠模型对FGFR2在颅骨发育中的调控作用有突破性研究,但目前对其在长骨发育中的作用及成骨分化中的具体作用机制研究较少。综上所述,本研究将以Fgfr2S252W/+小鼠和BMSCs作为研究平台和实验切入点,通过比较野生型小鼠和Fgfr2S252W/+小鼠的长骨骨量、BMSCs的生物学特性、BMSCs成骨分化能力.BMSCs的基因差异表达,从整体动物水平、细胞及分子水平研究FGFR2S252W突变中BMSCs的生物学变化、FGFR2 S252W突变对BMSCs成骨分化的调控作用及其分子机制、FGFR2调控BMSCs成骨分化中与其它信号通路的协同作用。本研究不仅对于深入认识Apert综合征病理生理机制意义重大,而且能够揭示FGFR2参与调控BMSCs成骨分化的作用及机制,为骨再生和骨骼相关疾病治疗的新策略提供理论和实验依据。方法：为了获取Fgfr2S252W/+小鼠进行实验,我们首先对Fgfr2S252W/+小鼠进行保种、繁殖、基因型鉴定。Micro-CT扫描并分析来自2月龄和5月龄小鼠的股骨骨量。骨量的分析数据包括：骨小梁和骨皮质体积分数(Tb.BV/TV, Ct.BV/TV,%),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁和骨皮质的厚度(Tb.Th, Ct.Th),骨小梁分离(Tb.Sp),骨小梁结构模型指数(Tb.SMI),骨小梁和皮质骨矿物质密度(Tb.BMD, CT.BMD)。利用H&E染色和Von Kossa染色对脱钙骨和未脱钙骨进行组织学分析,以确定Fgfr2S252W/+小鼠中骨量的改变是否是由于骨骼的形成改变导致。OsteoMeasure系统分析胫骨的Tb.BV/TV和Tb.Sp。测定小鼠血清中总钙和磷酸盐水平,以确定在Fgfr2S252W/+小鼠中观察到的骨骼异常是否与系统性的矿物质平衡改变有关。PINP是一种敏感和特异性的成骨细胞活性标志物,所以我们用ELISA法检测血清中PINP的水平。从6至8周龄同窝野生型和Fgfr2S252W/+小鼠股骨和胫骨获得BMSCs。利用流式细胞仪技术对野生型和jFgfr2S252W/+小鼠来源的BMSCs进行干细胞表面分子标志物的检测。为了比较野生型和Fgfr2S252W/+小鼠来源的BMSCs的功能,我们采用CCK-8法以及流式细胞仪检测BMSCs增殖、生长周期以及凋亡。为了进一步比较两种小鼠来源的BMSCs多向分化能力差异,对两种BMSCs进行了成骨和成脂的定向诱导分化实验,同时采用油红O染色和茜素红染色对脂滴和矿化结节进行检测,采用RT-PCR对成骨以及成脂的关键基因Oc、Runx2与PPARγ、LPL进行检测。为了解FGFR2功能获得性突变对小鼠BMSCs成骨分化能力的影响,我们对W-BMSCs和M-BMSCs两组细胞进行成骨能力检测。首先将BMSCs成骨诱导4 d、7d、14 d后,检测成骨早期标志基因ALP的活性和染色。然后将BMSCs成骨诱导7 d、14d和21 d后采用免疫荧光方法检测成骨的关键蛋白Op, Oc的表达情况,同时采用RT-PCR进一步确定细胞成骨基因Col-I, Op, Oc, Runx2和OSX的表达水平。最后将细胞成骨诱导21d后,采用茜素红染色检测其矿化能力。为研究FGFR2 S252W功能获得性突变影响下BMSCs成骨分化中与其它信号通路的协同作用,我们利用基因芯片技术比较分析W-BMSCs和M-BMSCs两组细胞基因差异表达,找到有意义的基因。利用基因芯片技术中聚类分析芯片数据分析发现,M-BMSCs中Wnt信号通路的抑制基因SFRP1、FRP2和SFRP4表达上调。这种上调采用RT-PCR和Western Blot进行验证。SFRP1、SFRP2和SFRP4是Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂,我们猜测Wnt/β-catenin信号通路在FGFR2 S252W功能获得性突变下受到了抑制。为验证这一猜想,我们将W-BMSCs和M-BMSCs成骨诱导7d和21 d,分离提取胞浆、胞核蛋白,利用Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路的枢纽分子β-catenin的表达情况,RT-PCR检测Wnt/p-catenin信号通路关键靶向基因cyclinDl, lefl, and fzd4的表达水平。如果Fgfr2S252W/+小鼠中BMSCs的生物学特性及成骨分化异常是由于Wnt/β-catenin信号通路被抑制造成,那么Wnt/β-catenin信号通路被激活可以减轻BMSCs的异常。Wnt3a可以上调Wnt/β-catenin信号通路,此部分实验我们将应用Wnt3a外源性重组蛋白调控Wnt信号通路。采用CCK-8分析加入Wnt3a后M-BMSCs细胞增殖能力,RT-PCR检测成骨基因Op,Oc, Runx2, OSX, Col-I以及成脂基因PPARγ、 LPL的变化趋势,ALP和茜素红染色观察改变Wnt信号通路活性后M-BMSCs成骨能力和矿化能力的变化。结果：1.小鼠股骨结构参数数据显示,2月龄Fgfr2S252W/+小鼠中Tb.N, Tb.Th, Ct.Th, Tb.BV/TV, Ct.BV/TV, Tb.BMD和(Ct.BMD均低于野生型小鼠。与野生型小鼠比较,2月龄Fgfr2S252W/+小鼠Tb.Sp升高。Tb.SMI在2月龄Fgfr2S252W/+小鼠中的增加进一步证实了以上结果。尽管5月龄Fgfr2S252W/+小鼠 Ct.BMD比野生型小鼠低,其Tb.N, Tb.Th, Ct.Th, Tb.BV/TV, Ct.BV/TV, Tb.BMD均高于野生型小鼠。Tb.Sp在5月龄Fgfr2S252W/+小鼠中降低。以上差异由显著减少的Tb.SMI结果进一步证实。总的来说,这些观察结果表明FGFR2 S252W功能获得性突变改变了成年小鼠的骨量和骨结构特性。Von Kossa染色结果显示,2月龄Fgfr2S25W/+小鼠骨小梁间隔大于野生型小鼠,5月龄Fgfr2s252W/+小鼠骨小梁比野生型小鼠长、密。2月龄Fgfr2S2S2W/+小鼠骨小梁Tb.BV/TV显著低于野生型小鼠,5月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨小梁Tb.BV/TV高于野生型小鼠。Tb.Sp在2月龄Fgfr2S252W/+小鼠中显著升高,在5月龄Fgfr2S252W/+小鼠中降低。这些结果与Micro-CT扫描结果一致。2月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨小梁内衬成骨细胞数量少于野生型小鼠。5月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨小梁内衬成骨细胞形态更立体、更丰满。与同窝野生型小鼠比较,2月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨小梁内衬类骨样组织薄,5月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨小梁内衬类骨样组织厚。Fgfr2s252W/+小鼠中类骨样组织增厚表明Fgfr2S252W/+小鼠出现骨基质矿化异常。Fgfr2S252W/+小鼠和野生型小鼠血清中,无论是总钙水平还是总磷水平均没有显著性差异。2月龄Fgfr2S252W/+小鼠血清PINP水平显著低于野生型小鼠,5月龄Fgfr2S252W/+小鼠血清PINP水平显著高于野生型小鼠。2.与W-BMSCs细胞相比,M-BMSCs的细胞形态无显著性差异,但细胞数量较少。通过干细胞分子表面标记物检测发现两种细胞表达相似的细胞表型,但M-BMSCs司充质细胞表面标志分子CD9C1、CD105、CD146呈弱阳性表达。M-BMSCs的增殖能力显著低于W-BMSCs。 M-BMSCs的早期和晚期凋亡能力显著高于W-BMSCs。成脂诱导21d时,M-BMSCs的成脂分化能力显著低于W-BMSCs;成骨诱导21d时,M-BMSCs的成骨分化能力显著高于W-BMSCs。3.ALP染色和活性检测结果显示,成骨诱导4 d、7d和14d时,M-BMSCs的ALP活性低于W-BMSCs,除14d外,其差异有显著性。免疫荧光结果显示在成骨诱导7 d、14d和21d后W-BMSCs、M-BMSCs两组细胞均表达成骨早期和晚期标志性蛋白Oc、Op。RT-PCR结果显示,FGFR2 S252W功能获得性突变作用下,BMSCs成骨诱导4d时Col-I、Op、Oc、Runx2、OSX的表达水平显著低于W-BMSCs.成骨诱导第7d时,M-BMSCs中Op、Oc、OSX的表达水平显著低于W-BMSCs; Runx2虽低于W-BMSCs,但其差异无显著性；此时,M-BMSCs中Col-I表达高于W-BMSCs,成骨诱导第14d时,虽然M-BMSCs中Op、Oc、Runx2的表达水平仍显著低于W-BMSCs,但Co1-I的表达水平显著高于W-BMSCs; OSX的表达水平也高于W-BMSCs。成骨诱导21d后,M-BMSCs中5种成骨关键蛋白均显著高于W-BMSCs组。茜素红染色和钙沉积量的定量分析显示,M-BMSCs的成骨矿化能力显著高于W-BMSCs。4.利用基因芯片技术中聚类分析芯片数据分析发现,M-BMSCs中Wnt/β-catenin信号通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和5FRP4表达上调。RT-PCR和Western Blot结果进一步证实了SFRP1、SFRP2和SFRP4的表达上调。成骨诱导7d和21d后,Western Blot结果提示M-BMSCs胞浆和胞核中β-catenin的表达低于W-BMSCs。 M-BMSCs和W-BMSCs中,P-catenin的表达随着成骨诱导的时间增加而降低,M-BMSCs降低程度高于W-BMSCs。与β-catenin表达结果一致的是,RT-PCR结果也显示M-BMSCs中Wnt/β-catenin信号通路的关键靶基因cyclinD1, lefl和fzd4的表达低于W-BMSCs,这些基因在成骨诱导第21d的表达水平低于成骨诱导第7 d。5.加入Wnt3a,上调Wnt/β-catenin信号通路后,M-BMSCs增殖能力增强。成脂诱导之后观察到M-BMSCs的成脂分化能力显著增强。ALP活性和染色结果证实,在成骨诱导第7d及14 d,Wnt3a的加入促进了M-BMSCs的成骨能力。然而,成骨诱导第21 d,Wnt3a抑制了 M-BMSCs的矿化能力；成骨诱导第21 d,Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs中成骨相关基因Col-I, Oc, Runx2的表达显著降低进一步证实了Wnt3a抑制M-BMSCs矿化能力的结果。结论：1、对2月龄和5月龄Fgfr2S252W/+小鼠长骨的骨量、骨结构特性及成骨细胞活性进行研究,发现随着年龄的增加,Fgfr2S252W/+小鼠的骨量没有丧失,反而增加,与野生型相比,2月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨发育受到抑制而5月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨发育反而高于野生型。其原因与全身机体的系统性矿物质平衡无关,可能是由成骨细胞的活性改变。2> FGFR2 S252W功能获得性突变未改变小鼠BMSCs干细胞标记物特点,但影响了干细胞的数量、增殖能力、多向分化能力及凋亡。这为进一步探讨Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs的功能提供了基础。3、FGFR2 S252W功能获得性突变在成骨分化早期BMSCs的骨向分化潜能受到抑制,但在晚期却促进BMSCs的成骨矿化。这与小鼠体内观察到的与年龄相关的骨发育状况的改变情况一致。4、FGFR2 S252W功能获得性突变抑制了BMSCs的Wnt/β-catenin经典信号通路。并且通过上调Wnt/β-catenin信号通路能够恢复或部分逆转BMSCs增殖、成脂分化及骨向分化功能的异常。提示：Wnt/β-catenin信号通路的抑制可能是FGFR2 S252W功能获得性突变的BMSCs成脂、成骨分化能力改变的主要原因之一总之,本研究确证了与年龄相关的Fgfr2S252W/+骨量和骨结构特性表型的改变,同时证实Wnt/β-catenin经典信号通路的失调是导致Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs成骨分化异常的关键因素之一。本研究不仅有助于对于深入认识Apert综合征的病理生理机制,而且揭示了FGFR2参与调控BMSCs成骨分化的作用机制,能够为骨再生和相关骨骼疾病治疗新策略的提出,提供理论和实验依据。