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苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）4.0718菌株（CCTCC NO．200016）对小菜蛾（Plutella xylostella）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）等鳞翅目昆虫具较高毒性，本研究分离并提纯了其杀虫晶体蛋白基因；运用PCR方法分析4.0718菌株的基因型，并进行了克隆。 实验结果如下： 采用改进的Triton X-100温和裂解法进行趴4.0718菌株的质粒DNA的抽取，取得较理想效果。用0.6％TritonX-100和1 mol／L NaCl的混合液处理菌体，90min的裂解时间效果为好。提取的质粒DNA受到的损伤小，并且酶的抑制剂含量也较少。在0.5％琼脂糖凝胶电泳中，质粒DNA分离相当清晰。Bt 4.0718菌株含有4个大小不等的质粒，依据其分子量大小顺序依次编号为P1、P2、P3和P4。 采用几种不同的方法回收4.0718菌株的质粒DNA，主要有制备档板挖孔的方法、液氮冻融法和低熔点琼脂糖法。实验中对这三种回收方法进行了不同程度的改进，使它们皆可高质高效的回收Bt 4.0718菌株质粒DNA，基本不受DNA分子长度和量的限制。 目前研究表明，苏云金杆菌cry1、cry2和cry3类基因编码的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs或Cry蛋白）对鳞翅目昆虫有毒性，并且我室的Bt 4.0718菌株对鳞翅目昆虫有较强毒性。对ee;lba:Ik中eryl一、cryZ一和Cry3一型基因的高度保守区进行同源序列比较，设计了3对通用引物cryl〔U;:l（d）/U，飞一（r）]、eryZ[UnZ（d）/UllZ（r）]和ery3〔U，飞3（d）/U;飞3（，·）]。并根据eryl一和cryZ一型基因的高变区设计特异引物:55、!，11/s3t川l（e ryl人a，ery1Ab，ery1Ac，cry1B，ery1Ca，℃ry1Cb）和SsunZ/s3unZ（cryZAa，cryZ人b，cryz人e）。PCR扩增结果表明质粒P4没有杀虫晶体蛋白基因，质粒P、、p，和p3在用eryl[Unl（d）/Unl（r）]和cryZ【UnZ（d）/UnZ（r）」两对引物扩增时分别产生了277bp和689bp的产物，分别对应cryz一和cryZ一型基因;通用引物cry3[U，13（d）/U，13（r）]没有扩增出DNA片段，说明质粒中不存有cry3型基因。为了对4.07 18菌株的亚类基因型进行精细分析、必须进一步的PCR鉴定。质粒P，用特异引物扩增出1641、1623、1219bp和1471bp的DN八片段，分别对应于cryzAc、cry1Cb、cryZAc和新的Cry基因（暂定名为ery4.5基因）。质粒PZ扩增出的PeR产物大小是1 6 35、1 6 23和1 2 1 gbp，分别对应于ery1Aa、ery1Cb和cryZ八c基因。质粒P3扩增出1623、一557和1219bp的产物，分别对应于ery1Cb、erylAb和eryZAe基因。PCR扩增的数据表明，4.0718菌株含有多个与Cfy家族有关的杀虫基因。即含有cry1Aa、cryl^b、cry1Ac、cry1Cb、cryZ入c和新的cry基因 （。ry4.5基因）等基因型。像Bt 4.0718菌株这样基因类型含量丰富的Bt，国内外报道尚少，这证明Bt 4.0718菌株有重要的研究价值和应用价值。 实验中采用山lljll/Pstl双酶切质粒DNA，寻找携带新基因的片段。发现新基因cry4.5在4.skb酶切片段上，另外还有一5.okb片段携带cry基因。分别回收两片段，将它们与双功能载体nllT3叫进行重组，转化感受态细胞丑coj j Dll sa。通过蓝/白斑显色反应和重组质粒酶切鉴定获得重组子pB t4。