论文部分内容阅读
植物在生长发育过程中会遭遇各种逆境,WRKY转录因子家族在这其中几乎都有参与,本研究以丹东蒲公英（Taraxacum antungense Kitag.）为试验材料,研究了两种非生物胁迫,两种激素诱导后四种苯丙烷代谢途径中关键酶基因相对表达量的变化,克隆了一名WRKY转录因子家族成员,对其进行研究,试验结果如下:1.在丹东蒲公英中成功克隆得到了WRKY转录因子家族一名成员并命名为TaWRKY14（基因登录号:MH513939）,TaWRKY14转录因子,全长1056 bp,编码351个氨基酸。TaWRKY14氨基酸序列的保守结构域与拟南芥AtWRKY14的相同。系统发育树结果显示TaWRKY14是WRKY IIe亚族基因,其亲缘关系最接近的是丹参中的WRKY40。2.利用qRT-PCR对TaWRKY14表达模式进行分析,对丹东蒲公英根、叶柄、叶、花中的WRKY14进行组织特异性分析,结果表明WRKY14在丹东蒲公英根中含量最多,根>叶>叶柄>花,以叶中基因相对表达量视作1,根中的相对表达量高达4.8倍,其次是花和叶柄,在叶柄中表达量为0.65倍。根内TaWRKY14基因相对表达量约比花高出20倍,比叶片高出4.8倍,比叶柄高出7倍。丹东蒲公英干旱胁迫结果显示,叶中的TaWRKY14呈现的上调趋势最明显,表明TaWRKY14受干旱胁迫因子诱导;500 mM NaCl水溶液处理后TaWRKY14表达量呈上升趋势;100μmol/L SA处理后基因相对表达量呈现先上调后恢复的趋势;100μmol/L MeJA处理后,叶中的TaWRKY14表达量变化差异不显著。3.利用高效液相色谱法对非生物胁迫以及激素诱导处理后的丹东蒲公英叶中的有效成分含量（绿原酸及咖啡酸）进行测定,结果表明在用100μmol/L MeJA处理后的叶中绿原酸及咖啡酸都呈上升趋势;100μmol/L SA处理后的叶中绿原酸及咖啡酸也呈现上升趋势;干旱处理后的叶中绿原酸含量呈现上升趋势,而不同浓度NaCl水溶液处理后的叶中咖啡酸呈先下降后上升的趋势。之后利用qRT-PCR分析两种非生物胁迫,两种激素诱导后丹东蒲公英叶中苯丙烷代谢途径四种关键蛋白酶:C4H、ANS、HCT及CHI基因相对表达量的变化,盐胁迫处理后TaCHI呈现出先上调后恢复的趋势与TaWRKY14的基因相对表达量变化趋势一致,干旱胁迫后TaC4H呈现先上调后恢复的状态与TaWRKY14的基因相对表达量变化状态一致。4.通过启动子元件分析并构建酵母单杂交载体,结果表明TaWRKY14与TaC4H,TaWRKY14与TaCHI的启动子能在酵母体内结合,TaWRKY14可能参与调控TaC4H以及TaCHI。构建TaWRKY14的原核表达载体后,通过试验优选条件,当OD600=0.6、IPTG的诱导浓度为0.8 mmol/L、诱导时间为3 h及温度等于37°C时,能够成功诱导出分子量为58.5 KDa的目的蛋白,确定了最佳的诱导条件。而后构建GFP亚细胞定位载体,结果显示TaWRKY14定位在细胞核中。