Ⅰ型胶原蛋白对ADSCs及EPCs体外增殖与分化的调控机制研究

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:juju108
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[目 的]探讨I型胶原蛋白(Collagen I)在体外对脂肪干细胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSCs)及内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)增殖与分化的调控机制,为种子细胞生长增殖提供良好微环境,为干细胞体外培养提供简便方法,为脂肪移植物早期血管化和提高其成活率提供理论依据。[方法](1)体外培养并鉴定大鼠成纤维细胞、ADSCs及EPCs,大量扩增并收获成纤维细胞,采用酸提取法提取胶原蛋白、纯化,并采用Western Blot鉴定胶原蛋白。(2)CCK-8法探索适合ADSCs增殖的最佳浓度为0.1mg/ml,并描绘生长曲线;0.1mg/ml浓度的I型胶原蛋白对不同代次ADSCs增殖能力进行检测;0.Img/ml浓度的I型胶原蛋白包被Transwell小室下室(胶原组),对照组小室下室不做处理,胶原组和对照组上室接种细胞数分别为3 ×104/孔,分别在24h、48h和72h染色并计数迁移细胞数;RT-qPCR分别检测胶原组与对照组中ADSCs表达VEGFA的量;胶原组细胞和对照组细胞分别进行成脂分化、成骨分化和成软骨分化,分别在第3天、第10天和第5天将各组细胞进行染色,观察其形态,另一部分细胞收样提取RNA,RT-qPCR检测各组早期成脂、成骨、成软骨基因表达量。(3)CCK-8法探索适合EPCs增殖的最佳浓度为5μg/cm2,并描绘生长曲线;5 μg/cm2浓度I型胶原蛋白对不同代次EPCs增殖能力进行检测;5μg/cm2浓度的Ⅰ型胶原蛋白包被Transwell小室下室(胶原组),对照组小室下室不做处理,胶原组和对照组上室接种细胞数分别为3 ×104/孔,在24h、48h染色并计数迁移细胞数;RT-qPCR检测胶原组和对照组EPCs表达VEGFA、VEGFR1、vWF、CD133、CD31的量;基质胶上接种胶原组、对照组大鼠的EPCs,显微镜下在2h、4h时间点观察各组成管情况,随机选取5个视野拍照,用Image J统计成管总长度和分支节点数;用Trizol法收集成管前与成管时EPCs样品送公司测基因组序列,并用RT-qPCR验证测序结果;采用Trizol法提取胶原蛋白处理和对照组EPCs总RNA,采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测胶原组和对照组中EPCs基因表达量。[结 果](1)成纤维细胞提取纯化出I型胶原蛋白。(2)0.1mg/ml浓度的I型胶原蛋白对ADSCs增殖能力最强(p<0.05),且0.1mg/ml浓度的I型胶原蛋白对不同代次细胞的增殖能力均强于对照组(p<0.05)。(3)Ⅰ型胶原蛋白对ADSCs迁移能力明显强于对照组(p<0.05)。(4)Ⅰ型胶原蛋白组中 ADSCs 表达 VEGFA、PPARG、RUNX2、COMP 的量明显多于对照组(p<0.05)。(5)5μ/cm2浓度的Ⅰ型胶原蛋白对EPCs增殖能力最强(p<0.05),且5μg/cm2浓度的Ⅰ型胶原蛋白对不同代次EPCs的增殖能力均强于对照组(p<0.05)。(6)Ⅰ型胶原蛋白对EPCs迁移能力明显比对照组差(p<0.05)。(7)Ⅰ型胶原蛋白组中EPCs表达CD31、VEGFR1、VEGFA、vWF的量明显低于对照组,表达CD133的量明显高于对照组(p<0.05)。(8)Ⅰ型胶原蛋白可以上调细胞周期、粘附分子、代谢过程。(9)Ⅰ型胶原蛋白可以激活PI3K/Akt信号通路,且Ⅰ型胶原蛋白组中表达PI3K和Akt基因的量明显高于对照组(p<0.05)。[结 论](1)本实验成功从成纤维细胞提取出Ⅰ型胶原蛋白,为Ⅰ型胶原蛋白的提取提供新方法。(2)Ⅰ型胶原蛋白可以诱导ADSCs增殖、趋化,为脂肪移植后脂肪再生提供良好微环境。(3)Ⅰ型胶原白通过上调细胞周期和代谢过程促进EPCs增殖。(4)Ⅰ型胶原蛋白通过上调PI3K/Akt信号通路和粘附分子促进EPCs血管形成,为脂肪移植早期血管化提供理论依据。(5)Ⅰ型胶原蛋白可以保持干细胞多向分化潜能,为脂肪移植联合干细胞应用提供新方法。
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