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研究背景及目的:TRIBs(Tribbles)蛋白家族为一种具有假激酶结构域的支架蛋白(Scaffolding Protein),在哺乳动物细胞中存在TRIB1、2、3三种亚型,均与包括E3泛素连接酶COP1(Constitutive photomorphogenic protein1,组成型光形态发生蛋白1)在内的多种信号分子结合,调控众多细胞生物学过程。从结构上来说,TRIBs蛋白主要由三部分组成:氨基端(N端)、中间假激酶样结构域以及羧基端(C端)。TRIBs蛋白N端均含有一个富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)这四种氨基酸的结构域,称为“PEST”结构域,一般认为具有PEST结构域的蛋白质均不稳定。前人研究表明,在哺乳动物脂肪细胞中,限制细胞培养基中葡萄糖的浓度,可增强TRIB3的稳定性,TRIB3与COP1结合降解乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl Co A carboxylase,ACC),限制脂肪酸的合成;在肝脏细胞中,TRIB1的过表达能够降低脂肪酸氧化和甘油三酯合成,并且TRIB1的表达水平与葡萄糖浓度呈负相关,因此,TRIB1和TRIB3在细胞能量代谢过程中均发挥重要作用。另有研究表明,在体内外葡萄糖饥饿条件下脂肪细胞TRIB3的表达水平显著升高,但这一现象是否也存在于其它细胞中,现仍不明确。值得关注的是,肝癌细胞中的TRIB2在基础培养条件下也具有不稳定性。现有研究认为TRIB2在某些黑色素瘤、肝癌、急性白血病等多种恶性肿瘤细胞中常作为一个癌基因,与肿瘤的发生、发展密切相关。那么TRIB2作为TRIB家族中的一员,它在细胞能量代谢过程中是否发挥作用?发挥何种作用?对肿瘤的生物学功能有何影响?目前尚缺乏研究。为了探讨TRIB2是否在细胞能量代谢过程中发挥作用,我们选择TRIB2蛋白高表达的黑色素瘤细胞作为研究模型,在体外利用葡萄糖饥饿、氨基酸饥饿、2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)等多种营养应激条件处理细胞,结果发现在上述营养饥饿状态下TRIB2蛋白表达明显下降,而且TRIB2蛋白表达下降是由蛋白酶体介导的,首次揭示TRIB2蛋白稳定性接受细胞营养信号的调控。基于TRIB2含有PEST结构域以及TRIB2蛋白稳定性受COP1、β-Tr CP(β-transducin repeat-containing protein,β-转录重复包含蛋白)和Smurf1(SMAD Specific E3 Ubiquitin Protein Ligase 1,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1)等多种E3泛素连接酶调控的前人报道,但这些研究均在基础细胞培养条件下进行,因此,我们研究了TRIB2 PEST结构域以及这三个E3泛素连接酶在葡萄糖饥饿状态下是否介导了对TRIB2蛋白降解效应。在排除了PEST结构域以及COP1、Smurf1 E3泛素连接酶的作用后,通过TRIB2氨基酸序列分析,我们发现TRIB2氨基酸序列存在着一个潜在的β-Tr CP结合序列DSGX(2-4)S(其中天门冬氨酸(D)也可以是磷酸化的S或T,X可以是任何一个氨基酸,而其中两个S均需要通过磷酸化修饰),因这个基序中的S或T均需要在磷酸化修饰的前提下才能被β-Tr CP这个E3连接酶识别,也被称为磷酸化降解体(phosphodegron),因此,我们进而探究了β-Tr CP是否介导了葡萄糖饥饿状态下对TRIB2的降解效应,并对葡萄糖饥饿状态下激活的AMPK(AMP-activated protein kinase)是否参与磷酸化TRIB2 phosphodegron开展了研究,旨在揭示葡萄糖饥饿状态下TRIB2蛋白降解的分子机制。越来越多的研究表明TRIB2作为一个癌基因在某些黑色素瘤、肝癌、急性白血病等多种恶性肿瘤细胞中表达升高,与肿瘤的发生、发展密切相关。尽管TRIB2作为一个癌基因在肝癌、急性白血病等肿瘤发生中的作用机制得到研究,但它在黑色素瘤细胞中的功能及作用机制仍研究甚少,而TRIB2与黑色素瘤细胞能量代谢的关系更是未见报道,本研究旨在揭示黑色素瘤细胞中TRIB2与细胞能量代谢的关系及其分子机制,为探索新的黑色素瘤治疗策略提供实验依据。研究方法:(1)利用各种营养应激条件在体外处理黑色素瘤细胞,通过Western Blot观察TRIB2蛋白表达水平;(2)利用蛋白酶体、Cullin neddylation抑制剂研究饥饿状态下TRIB2蛋白表达下降是否由蛋白酶体和Cullin依赖性的E3连接酶介导;(3)利用重叠PCR(Overlapping PCR)技术制备PEST结构域去除的TRIB2突变体,验证“PEST”结构域是否介导了饥饿状态下的TRIB2的降解;(4)利用sh RNA干扰技术静默COP1的表达水平以及COP1结合缺陷型TRIB2突变体研究营养应激条件下TRIB2的表达水平及其稳定性;(5)利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)技术、GST融合蛋白下拉实验(GST-Pulldown Assay)和Peptide-Pull-Down研究TRIB2与E3泛素连接酶β-Tr CP之间是否存在结合;(6)利用Cullin1和β-Tr CP sh RNA基因静默等手段,研究Cullin1依赖的E3泛素连接酶β-Tr CP对TRIB2蛋白稳定性的调控作用;(7)利用体内泛素化实验(In vivo ubiquitination assay)阐释Trib2是否为E3泛素连接酶β-Tr CP的降解底物;(8)利用DNA点突变(site-directed DNA mutagenesis)技术将TRIB2 c DNA上潜在的Phsphodegron序列中的丝氨酸(S)/苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A),使其不能接受磷酸化修饰,研究该突变体与E3泛素连接酶β-Tr CP的结合能力及其在营养应激状态下的蛋白质稳定性;(9)利用多种AMPK激活剂研究AMPK激活状态下对TRIB2表达的影响,并比较研究过表达TRIB2的野生型小鼠胚胎成纤维(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF)细胞与AMPK基因敲除的MEF细胞中TRIB2蛋白稳定性对营养应激的反应,初步揭示蛋白激酶AMPK在营养应激状态下对TRIB2降解的调控作用;(10)利用GST融合蛋白下拉实验研究AMPK是否与TRIB2结合;(11)利用体外蛋白激酶实验(In vitro kinase assay)在细胞外模拟磷酸化环境,研究蛋白激酶AMPK能否在体外对大肠杆菌表达、无翻译后修饰的TRIB2蛋白产生磷酸化修饰;(12)利用肿瘤细胞克隆形成实验研究TRIB2对黑色素瘤细胞在体外克隆形成的影响。研究结果:(1)在葡萄糖饥饿、氨基酸饥饿、2-DG处理等营养应激条件下,黑色素瘤细胞中TRIB2的蛋白表达明显下降。(2)蛋白酶体抑制剂和Cullin类泛素化修饰(neddylation)抑制剂增强基础培养条件下黑色素瘤细胞TRIB2蛋白的表达水平,neddylation抑制剂逆转葡萄糖饥饿诱导的黑色素瘤细胞TRIB2蛋白的降解。(3)去除“PEST”结构域的TRIB2在葡萄糖饥饿状态下其降解速度与野生型TRIB2无显著差别。(4)在基础培养状态下,尽管COP1静默的黑色素瘤细胞中TRIB2表达水平显著升高,但是葡萄糖饥饿状态下,COP1静默细胞中的TRIB2蛋白仍然降解,而且COP1结合缺陷型TRIB2突变体在葡萄糖饥饿状态下其蛋白降解速率与野生型TRIB2无显著差别。(5)β-Tr CP与TRIB2二者不仅可以免疫共沉淀,而且GST-TRIB2融合蛋白成功下拉细胞内源性β-Tr CP,TRIB2 phosphodegron预先经磷酸化处理的合成短肽成功下拉内源性β-Tr CP,而未经磷酸化处理的相同短肽则不能下拉β-Tr CP。(6)利用慢病毒介导的sh RNA成功静默黑色素瘤细胞Cullin1或β-Tr CP的表达,导致葡萄糖饥饿状态下TRIB2蛋白稳定性的增强。(7)体内泛素化实验证明,在葡萄糖饥饿状态下β-Tr CP促进TRIB2的泛素化。(8)Phosphodegron序列突变体TRIB2-3A(将TRIB2 T226、S227、S231突变为丙氨酸A)与野生型TRIB2相比,与β-Tr CP免疫共沉淀效率明显下降,GST-TRIB2-3A融合蛋白下拉β-Tr CP能力与野生型TRIB2-GST融合蛋白相比也显著降低。在体内泛素化实验中,TRIB2-3A突变体在葡萄糖饥饿条件下接受β-Tr CP泛素化的程度与野生型TRIB2相比也明显减弱。(9)蛋白激酶AMPK在葡萄糖饥饿条件下被激活,同时伴随着TRIB2稳定性的下降。在葡萄糖饥饿状态下,在野生型MEF细胞中过表达的TRIB2被迅速降解,而在AMPK基因敲除的MEF细胞中过表达的TRIB2蛋白稳定性明显提高,初步表明AMPK在葡萄糖饥饿状态下促进TRIB2降解。(10)GST-TRIB2融合蛋白成功下拉内源性AMPK。(11)体外蛋白激酶实验表明AMPK在体外能够对大肠杆菌表达、无翻译后修饰的TRIB2蛋白产生磷酸化修饰,但不能对TRIB2-3A蛋白进行磷酸化。(12)TRIB2表达增强黑色素瘤细胞在体外的克隆形成。研究结论:本研究首次揭示TRIB2蛋白在诸多营养应激信号的刺激下迅速降解,因Cullin neddylation抑制剂可以逆转这一降解作用,说明TRIB2的降解是由Culllin依赖性的E3泛素连接酶以及蛋白酶体介导的。与其它具有PEST结构域的蛋白不同,TRIB2的PEST结构域对葡萄糖饥饿状态下TRIB2蛋白的降解不产生调控作用。因Cullin neddylation抑制剂逆转葡萄糖饥饿诱导的TRIB2的降解,基本排除HECT结构域家族E3泛素连接酶Smurf1介导TRIB2降解的可能性。而COP1静默细胞在葡萄糖饥饿状态下仍保持TRIB2降解能力以及在葡萄糖饥饿状态下COP1结合缺陷型TRIB2突变体的降解速度与野生型TRIB2相比没有显著差异,说明在葡萄糖饥饿状态下COP1并不是介导TRIB2降解的主要E3泛素连接酶。而以下实验结果表明蛋白激酶AMPK和E3泛素连接酶β-Tr CP的协同作用导致TRIB2 phosphodegron的产生才是导致葡萄糖饥饿状态下TRIB2降解的主要分子机制:1)TRIB2、β-Tr CP存在免疫共沉淀、GST-TRIB2融合蛋白或TRIB2phosphodegron短肽成功下拉β-Tr CP,这些结果表明TRIB2与β-Tr CP之间存在物理性结合。2)在葡萄糖饥饿状态下,Cullin1或β-Tr CP的静默均稳定TRIB2,β-Tr CP过表达促进TRIB2体内的泛素化。3)TRIB2-3A突变体不仅与β-Tr CP的共沉淀能力下降,而且其GST融合蛋白下拉β-Tr CP的能力也显著减弱,而且在葡萄糖饥饿条件下TRIB2-3A突变体接受泛素化的能力明显减弱。4)GST-TRIB2融合蛋白成功下拉AMPK、AMPK在体外能够磷酸化野生型TRIB2而对3A突变体则丧失磷酸化能力、在葡萄糖饥饿条件下AMPK敲除的MEF中过表达TRIB2降解受阻而野生型MEF则快速降解,这些实验结果说明AMPK可能是介导TRIB2 phosphodegron磷酸化的蛋白激酶。本研究为探索TRIB2高表达的黑色素瘤的临床治疗提供全新思路,具有重要的理论价值和临床应用价值。