细丽毛壳菌发酵生产右旋糖酐酶的工艺条件优化及应用研究

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甘蔗制糖生产过程容易滋生肠膜明串珠菌,大量消耗蔗糖生成右旋糖酐。右旋糖酐会增加糖液粘度,影响煮糖与分蜜过程,它是白砂糖酸性絮凝物的主要成分。同时,右旋糖酐在糖汁中的积累会混淆转光度,造成糖汁的纯度虚假上升,影响生产分析管理。由于右旋糖酐酶降解右旋糖酐的高效性,开发一种安全来源的右旋糖酐酶成为制糖工业亟需解决的关键问题之一。本文以获得了美国食品和药物管理局(FDA)和与GB2760-2011《食品添加剂使用标准》使用批准的细丽毛壳菌发酵生产右旋糖酐酶,并用于糖汁澄清。本文主要考察细丽毛壳菌发酵产右旋糖酐酶的工艺条件;分离与纯化粗酶液得到纯酶,并研究其酶学性质;建立细丽毛壳菌发酵产酶过程中菌体生长、酶生成和基质消耗的动力学模型;将粗酶液用于糖汁澄清,试验其酶解效果。论文得到的主要结论如下:1.在考察的成分范围内,细丽毛壳菌发酵生产右旋糖酐酶的最佳碳源是右旋糖酐粗酐,浓度为25g/L;最佳氮源是酵母浸膏,浓度为10g/L;磷酸氢二钾和硫酸镁对产酶有重要影响,浓度均为2.5g/L。正交设计优化后产酶的最佳条件为:发酵时间92h,发酵初始pH值5.5,装液量20mL/250mL锥形瓶,接种量3%。按最佳优化条件进行三次平行实验,产酶酶活达到231.5U/mL。2.粗酶液经过硫酸铵分级沉淀、Sepharose6B凝胶过滤层析得到了电泳纯的右旋糖酐酶,其分子量约为70kDa,比酶活为18478.1U/mg,纯化倍数为7.7,回收率为29.2%。3.右旋糖酐酶的最适作用pH为5.5,在pH4.0-7.0之间可以保持相对稳定(相对酶活大于80%),最适作用温度为60℃C,在低于60℃C时比较稳定。金属离子Cu2+、Fe3+和Hg2+对酶活具有明显的抑制作用,抑制作用大小为Hg2+>Cu2+>Fe3+。右旋糖酐酶对右旋糖酐中连续的α-1,6糖苷键具有特异性。右旋糖酐酶对右旋糖酐T2000、右旋糖酐T500、右旋糖酐T70的米氏常数(Km)分别为3.2×10-、5.8×10-3和7.1×10-3mg/mL,最大反应速率(Vmax)分别为9.1、5.9和4.8mg/(mL·min)。4.采用Logistic equation模型和Luedekingpiret方程对细丽毛壳菌发酵动力学进行研究,得到了描述发酵过程的动力学模型。细丽毛壳菌菌体生长动力学模型为右旋糖酐酶生成动力学模型为:右旋糖酐消耗模型为:模型值与实验数据拟合较好。5.在混合汁、清汁、糖浆中添加等量粗酶液,除去的右旋糖酐分别为20%、13%、5%,在不改变常规亚硫酸法工艺的条件下,最适添加右旋糖酐酶的位置为混合汁箱。采用酶法-亚硫酸法澄清工艺制备清汁,加酶的中和汁沉降速度提高40%左右,过滤速度提高30%-50%,清汁混浊度减少60%,右旋糖酐含量降低20%。单因素实验得出在混合汁中使用右旋糖酐酶的条件为:右旋糖酐酶添加量10mg/kg,反应时间10min,反应pH值6.0,反应温度600C。
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