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实验目的:雄激素阻断疗法(androgen deprivation therapy,ADT)目前是前列腺癌最有效最常用的一线治疗方案,但此疗法平均只能控制前列腺肿瘤发展大约两年时间。此后,前列腺肿瘤几乎不可避免的复发并抵抗ADT且常伴有向其他器官的转移,发展到此阶段的前列腺癌往往表现为极低的存活期和极差的预后。因此,揭示导致前列腺肿瘤由激素敏感型发展为ADT抵抗型的机制,寻找能增强ADT疗效的新方案目前依然是前列腺肿瘤临床研究的重点之一。Notch信号通路作为多物种间高度保守的信号通路之一,已被证明在生物的发育和肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。但目前Notch信号通路在前列腺肿瘤ADT抵抗中的研究还很有限,因此本课题旨在探究Notch信号通路在前列腺肿瘤抵抗ADT中是否及发挥何种作用。同时,我们在另一项前列腺肿瘤抵抗ADT治疗的研究中发现了miR-302/367可以增强前列腺肿瘤抵抗ADT的能力,但其具体机制并不清楚。因此,我们也对miR-302/367增强前列腺肿瘤抵抗ADT的机制进行了研究。实验设计:首先利用生物信息学手段在Oncomine数据库中分析Notch信号通路主要组分在ADT复发前后的表达是否发生了变化。利用免疫组织化学染色方法在前列腺自发肿瘤的转基因小鼠模型(ransgenic adenocarcinoma of the mouse prostate,TRAMP)中进一步验证数据库分析的结果。选择对雄激素阻断治疗敏感的3株雄激素受体阳性的前列腺肿瘤细胞系(LNCaP,C4-2,22Rv1)为我们此次抗雄激素阻断研究的细胞系。使用PSA启动子驱动荧光蛋白表达的报告系统(PSAP-eGFP)分选LNCaP细胞中对ADT具有潜在抗性的细胞亚群并通过qPCR检测Notch受体在该细胞亚群中的表达水平。通过以上实验确定Notch信号通路在前列腺肿瘤发展到抵抗ADT阶段的过程中是否发生了变化。通过构建Notch信号通路驱动的荧光信号报告系统,观察Notch信号通路的表达及活性是否对ADT产生应答。通过构建Notch受体核内活性片段(NICD)诱导表达系统,诱导激活Notch信号通路,研究活化的Notch信号通路在抗ADT中发挥的作用。探讨使用DAPT(γ-secretase inhibitor(GSI)的一种)在体内体外是否对ADT疗效产生一定的影响。在对miR-302/367调控前列腺肿瘤抵抗ADT机制的研究中,我们采用了通过生物学软件TargetScan和Pic Tar software寻找miR-302/367可能的靶基因,并通过构建一系列可能靶基因的3’UTR的荧光素酶报告载体和突变靶基因3’UTR上miR-302/367可能结合位点的荧光素酶报告载体在miR-302/367过表达的PCa细胞系中进行荧光素酶活性分析实验进行验证。实验结果:对Oncomine数据库的数据分析后表明,Notch受体3(Notch3)和受体4(Notch4)的表达水平在抗ADT后复发的病人样本中明显上调,其中以Notch3的上调最为显著,而Notch信号通路其他组分的表达水平未有明显变化。在TRAMP小鼠肿瘤组织样本中同样观察到相同的结果。同样的,在雄激素非依赖型细胞系C4-2中Notch3的表达水平也显著高于雄激素依赖型细胞系LNCaP。利用PSAP-eGFP报告系统在LNCaP细胞系中分选得到的抗ADT细胞亚群中Notch3和Notch4的表达水平与非抗ADT细胞亚群相比也呈现高表达的状态。通过Notch信号荧光报告系统检测Notch信号通路的活性变化,发现无论是使用去除雄激素的血清进行细胞培养还是在细胞培养时加入雄激素受体拮抗剂,都可以可诱导PCa细胞Notch信号通路的激活。通过qPCR和Western Blotting发现在上述过程中Notch3的表达和活化水平随雄激素剥夺而上调,验证了ADT可以通过上调Notch3表达和活化水平激活Notch信号通路。使用诱导表达系统分别诱导表达4种NICD,发现在体外Matrigel?三维培养环境中,任意一种NICD均能激活Notch信号通路并使LNCaP细胞产生静息细胞样的表型并增强其抗ADT的能力。在ADT过程中同时使用DAPT抑制Notch信号通路,可显著增强ADT对3株雄激素受体阳性的前列腺肿瘤细胞系的生长抑制效果,表现为更低的增殖速度,更弱的克隆形成能力和更明显的诱导凋亡效果。将相应的细胞系在免疫缺陷型小鼠中构建皮下移植瘤模型并给予上述治疗,同样发现DAPT联合ADT可显著抑制皮下移植瘤的生长并增强ADT的抗肿瘤效果。在我们另一项关于miR-302/367介导的前列腺肿瘤抵抗ADT机制的研究中,我们发现Hippo YAP信号通路中的关键激酶LATS2的3’UTR区域包含两个miR-302/367的结合位点。LATS2 3’UTR及LATS2 3’UTR突变miR-302/367结合位点的荧光素酶活性分析实验表明在前列腺肿瘤中LATS2确实为miR-302/367的靶基因。实验结论:我们的研究发现Notch信号通路可以被ADT激活并增强前列腺肿瘤细胞对ADT的抵抗能力。体内体外实验显示,在使用ADT的同时联合使用Notch受体阻断剂可显著增强ADT疗效。本研究的结果暗示了Notch受体阻断剂联合ADT疗法具有潜在的临床应用价值,或可通过增强ADT疗效推迟复发时间,延长病人的存活期。在关于miR-302/367调控前列腺肿瘤抵抗ADT的机制的研究中我们确认了LATS2为miR-302/367在前列腺肿瘤细胞中的靶基因。