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背景皮肤黑素瘤是对人类危害最大的皮肤恶性肿瘤,传统治疗方法疗效差、复发率高。激光免疫疗法是集肿瘤靶向治疗和免疫治疗为一体的新的肿瘤治疗方法,临床治疗皮肤黑色素瘤疗效好、复发率低。前期实验发现该疗法通过产生光热效应增加热休克蛋白(HSPs)表达,进而激活细胞免疫是其主要抗瘤机制。光热治疗过程中肿瘤组织内温度呈梯度分布(即光热梯度)与疗效关系未见报道。本实验旨在进一步研究激光免疫疗法治疗小鼠皮肤黑色素瘤的疗效及免疫学机制,并初步探索光热治疗过程中的温度梯度及不同温度梯度内损伤相关分子模式(DAMPs)表达,为进一步优化激光免疫疗法提供理论依据。方法分两部分,即体内和体外部分。体内实验,采用B16F10小鼠黑素瘤细胞接种C57BL/6小鼠皮下,构建小鼠皮肤黑素瘤模型。将48只成瘤的皮肤荷瘤模型小鼠随机分为四组:对照组、咪喹莫特组、激光组和激光免疫组,每组12只,各组处理如下:对照组,成模小鼠无处理;激光组,只采用808 nm激光,0.75 W/cm~2,照射10 min;咪喹莫特组,每天外涂2次,共7天;激光免疫治疗组,采用咪喹莫特每天外涂2次×3天,再予808 nm激光0.75 W/cm~2,照射10 min,照光后予咪喹莫特每天外涂2次×3天。每3天详细观察并记录小鼠皮肤肿瘤大小及小鼠的生存情况。在照光结束后7天取各组肿瘤组织观察组织病理学变化情况;在照光结束后48小时取各组的引流淋巴结进行流式检测DC细胞活化情况;在照光结束后7天取各组的肿瘤组织进行免疫组化检测CD4~+、CD8~+T细胞浸润情况,同时取各组小鼠的引流相关淋巴结、脾脏组织进行流式细胞术检测CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞变化;在照光过程中,肿瘤组织内不同区域温度不同即成温度梯度变化,采用热成像仪测量肿瘤表面温度变化,热电偶测量肿瘤组织内部温度变化,描绘不同温度梯度内温度-时间变化曲线。体外实验,采用不同温度(37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)和咪喹莫特联合不同温度(37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)水浴B16F10细胞,复温24小时后采,用Western Blot和Elisa检测各温度区域DAMPs(HSP70、HSP90、HMGB1、CRT)表达变化。结果通过绘制瘤体体积变化曲线及小鼠生存时间曲线,激光免疫疗法可明显抑制瘤体体积生长,延长小鼠的生存时间;在治疗结束后7天各组病理结果显示:激光免疫组可完全清除小鼠黑色素瘤细胞,激光组可部分清除肿瘤细胞;双侧间隔接种肿瘤细胞,只治疗一侧肿瘤,发现激光免疫疗法对未治疗侧的肿瘤也抑制作用;在照光结束后48h取各组的引流相关淋巴结进行流式检测DC细胞活化情况,发现DC细胞活化在激光免疫组表达最高,在照光结束后7天取各组的引流相关淋巴结、脾脏组织进行流式检测CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞变化,各组的上述免疫学细胞无统计学差异;体外实验Western Blot检测不同温度联合咪喹莫处理后的B16F10细胞表达HSP70、HSP90 HMGB1和CRT的变化,通过与内参值β-actin的灰度比值得出HSP70、HSP90 HMGB1和CRT几种DAMPs均在40℃出现高表达,HSP70在55℃出现第二次高表达,HSP90、HMGB1和CRT在50℃出现第二次高峰。而不同温度处理后HSP70、HSP90、HMGB1的蛋白表达量在40℃,CRT在40℃、45℃蛋白表达量均有明显的升高。不同温度处理及不同温度联合咪喹莫特处理后的上清,elisa检测结果得HSP70、HSP90、HMGB1的释放高峰是一致的,分别在50℃、45℃、50℃,CRT的释放高峰在不同温度组是45℃,在不同温度联合咪喹莫特组是50℃;从总体来看,不同温度联合咪喹莫特的DAMPs释放量均比单独温度处理高。结论激光免疫疗法可以明显抑制小鼠皮肤黑色素瘤生长,延长小鼠的生存率;激光免疫疗法杀伤肿瘤的免疫学机制主要是刺激DC细胞活化成熟,将抗原提呈给T细胞,进一步杀伤肿瘤细胞;激光治疗时肿瘤组织内呈温度梯度变化,各温度区域内DAMPs表达不同,各种DAMPs表达在40-55℃范围内。