论文部分内容阅读
沙门菌(Salmonella)是一群寄生于人和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌,主要引起动物的败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症,严重影响了畜禽养殖及公共卫生,尤其对我国的养鸡业造成了巨大的经济损失。我国已将鸡白痢沙门菌的净化工作列为重点发展项目,净化工作的前提是精准的检测方法。现有的沙门菌抗体检测方法主要是玻板凝集,该方法操作方便快捷且成本低,但是其灵敏度和特异性都不高。因此,丞需开发新型的检测方法来替代这一传统的方法。单抗阻断ELISA检测抗体具有酶联免疫吸附试验的高度敏感性、快速性、简单性和单抗的高度特异性等优点,已经广泛的用于各种疾病的诊断。本研究制备了沙门菌特异性的单克隆抗体,以期为沙门菌病的快速诊断提供有效试剂。相关研究如下:1.抗沙门菌PagC蛋白单克隆抗体的制备本研究是通过生物信息学分析,发现沙门菌PagC蛋白具有高度保守性,且与其他肠杆菌的序列同源在68%以下。本试验采用大肠杆菌表达系统表达并纯化了鼠伤寒沙门菌PagC重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、亚克隆和间接ELISA方法的筛选,最终得到了 6株能稳定分泌抗rPagC单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为A、B、C、D、I、J,测定上清的间接ELISA 效价达到了:1:800-1:1600。Western blot试验表明,6株单抗都与rPagC蛋白反应性良好。2.Dot-blot筛选识别P1或P2表位的单克隆抗体将沙门菌PagC蛋白序列在NCBI上比对后得到两段在沙门菌属内保守、属间特异的氨基酸序列 CDRQASGSVEPEGIH(P1)和 CFKEHSTQDGDSFNKISSRKTGFA(P2),进行人工合成多肽序列。使用Sulfo-SMCC交联剂将钥孔血蓝蛋白KLH分别偶联上P1和P2,得到KLH-P1和KLH-P2。通过Ellman试剂盒验证偶联成功后,再使用Dot-blot试验鉴定这6株抗沙门菌PagC蛋白的单克隆抗体的抗原表位是否在P1或P2氨基酸上。结果显示,单克隆抗体J与KLH-P1有明显的反应印迹,而其他细胞上清仅与PagC有印迹,说明mAb J的抗原表位在线性的P1中。mAb J的交叉反应性试验结果显示,mAb J与纯化的PagC蛋白、鸡白痢沙门菌和鼠伤寒沙门菌PagC蛋白有反应,与大肠杆菌O1,宋内志贺菌和变形杆菌PagC蛋白无反应,与比对结果一致。mAb J可以作为候选的单抗用于沙门菌阻断ELISA检测方法的建立。3.抗合成肽P2单抗的制备由于未鉴定出抗原表位在线性的多肽P2上的单抗,故使用KLH-P2作为免疫原制备抗P2的单克隆抗体。最终经过间接ELISA和Western blot试验验证得到了 2株能稳定分泌抗P2单克隆抗体的杂交瘤细胞,1G6和3E5。1G6和3E5的间接ELISA效价分别为1:1600和1:3200。综上所述,本研究成功筛选到了识别沙门菌PagC中P1和P2表位的单克隆抗体mAb J和1G6、3E5,研究成果在鸡白痢的诊断中具有重要的应用价值。