论文部分内容阅读
凋亡不仅与胚胎发育、机体内环境动态平衡及免疫应答密切相关,也为肿瘤的研究开辟了新方向。肿瘤不仅仅是细胞无控性生长的结果,其与细胞凋亡异常或凋亡阻抑有着重要关系。细胞凋亡根据其起始转导因子不同分为外源性凋亡途径(死亡受体途径)和内源性凋亡途径(线粒体途径)。其中,外源性凋亡途径的起始转导因子为caspase-8(即FLICE,FADD-like interleukin-1-beta converting enzyme)。cFLIP(cellular FLICE-like inhibitory protein)为caspase-8抑制蛋白,1997年由Irmler等在研究恶性黑色素瘤时发现,其结构类似于caspase-8,但不具备酶活性。已有大量研究表明,cFLIP在多种人类肿瘤组织中过表达,在肿瘤的发生发展中起重要的调控作用。封闭cFLIP基因在胃癌、大肠癌、横纹肌肉瘤等肿瘤组织中的表达,能够有效提高细胞的凋亡率及其对化疗药物的敏感性。宫颈癌是严重危及女性健康甚至生命的三大恶性肿瘤之一,近年发病率明显增加,且趋向年轻化。尽管宫颈癌发生的确切分子机制尚不清楚,但研究表明其发生是多种致癌因素长期协同作用的结果,如人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持续感染、基因变异和免疫逃避等。关于cFLIP在宫颈癌的发生发展过程中有着何种作用,及其与HPV的相互关系,目前相关报道甚少。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术,其本质是由双链RNA诱导的细胞内同源基因的特异性转录后沉默现象,可高效、特异地沉默目的基因,成为目前肿瘤研究和治疗的强有力手段之一。基于上述研究进展,本课题进行如下研究:目的:1.检测宫颈病变组织中cFLIP与HPV-16E7的表达、相互关系及临床意义。2.应用shRNA封闭cFLIP基因在宫颈癌细胞中的表达,并解除对caspase-8的抑制作用。3.探索靶向cFLIP基因沉默,降低宫颈癌细胞增殖、提高细胞凋亡率及增强细胞对放疗、化疗药物敏感性的可能性。方法:1.免疫组织化学SP染色法检测40例宫颈癌、40例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及20例正常宫颈组织中cFLIP与HPV-16 E7的表达情况。2. RT-PCR、Weston Blot分别检测4株宫颈癌细胞Hela、Siha、C33a及Caski中cFLIPS、cFLIPL的mRNA与蛋白表达水平,并选择Hela细胞作后续研究。3.构建靶向cFLIP的shRNA质粒,脂质体2000转染Hela细胞,特异性封闭cFLIP基因表达,RT-PCR、Weston Blot检测基因封闭效果。4. Weston Blot检测下调cFLIP基因对caspase-8蛋白表达的影响;MTT比色法、流式细胞技术分析cFLIP基因表达下调对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响;激光共聚焦显微镜分析凋亡的形态学变化。5. Co60放疗、化疗药物顺铂、伊立替康处理Hela细胞,MTT比色法、流式细胞技术分析下调cFLIP基因对宫颈癌细胞放、化疗敏感性的影响。结果:1. cFLIP及HPV-16E7在正常宫颈组织、CIN与宫颈癌组织中的表达均依次增强(P<0.05)。CINⅠ组与CINⅡ～Ⅲ组及宫颈癌组比较cFLIP表达有显著性差异(P<0.05),宫颈癌组与CINⅡ～Ⅲ级组比较无显著性差异(P>0.05)。cFLIP表达阳性率与宫颈癌病理类型、组织学分级、淋巴结转移及临床分期无关。CINⅡ～Ⅲ组中HPV-16 E7(+)组cFLIP阳性表达率高于HPV-16E7(-)组的表达率(P<0.05);宫颈癌、CINⅠ组织中HPV-16E7(+)组和HPV-16 E7(-)组cFLIP阳性表达率无显著性差异(P>0.05)。2.宫颈癌细胞株Hela、Siha、C33a及Caski均存在cFLIPS、cFLIPL mRNA及蛋白的表达。3.靶向cFLIP的shRNA质粒转染宫颈癌细胞株,可有效封闭cFLIPS、cFLIPL在mRNA与蛋白水平的表达;并影响caspase-8蛋白表达的水平。4.下调cFLIP基因可阻抑Hela细胞增殖并诱导凋亡(P<0.05);能有效提高Hela细胞对放、化疗的敏感性(P<0.05)。结论:1. cFLIP与HPV-16 E7在宫颈癌组织中特异性高表达,cFLIP的特异性高表达是宫颈癌变的一个早期事件,并可能协同HPV-16 E7在宫颈癌癌前病变向宫颈癌的发展过程中起重要作用,共同促进肿瘤的发生。2. cFLIP可能成为宫颈癌新的诊断、治疗靶点,以cFLIP为靶向的RNA干扰技术有望应用于宫颈癌的防治。