水稻是世界上最重要的粮食作物之一,但是病害,尤其是稻瘟病、条纹叶枯病,对世界各国稻区水稻的生产造成了极严重的影响。培育水稻抗病新品种,提高植物的广谱抗性,这是当今农业发展的重要研究课题之一,也是关系到国计民生的重大问题。Rs-AFP1基因作为从萌发的小萝卜种子内提取的一种多肽,属于γ-硫堇蛋白,已证明其在离体条件下能够抑制多种真菌生长;白藜芦醇是植物处于恶劣环境下或遭到病原体侵害时,植物自身分泌的一种可抵御病菌感染的抗菌素,作为一种重要的植保素,它能够增强植物抵抗病原体的能力,并被证明对多种真菌性病害有抑制作用,而白藜芦醇合成酶作为其合成途径中的关键酶,对植物体内白藜芦醇合成及代谢具有重要的调控作用。本研究中,我们分别从萌发的小萝卜种子及花生未成熟种子cDNA文库中分离出Rs-AFP1基因以及白藜芦醇合成酶基因PNRSC。对这两个基因进行生物信息学分析,并将它们分别构建入经改造的以玉米泛素Ubiquitin为启动子、以bar基因为选择标记基因的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导的方法对黄淮区主栽品种“圣稻13”的成熟胚进行遗传转化并获得13株转Rs-AFP1基因的植株以及7株转PNRSC基因的植株。通过除草剂Basta涂抹以及PCR分子鉴定,确定转化Rs-AFP1基因的第1、4、6、7、10、13株系为阳性转基因植株,转化PNRSC基因的第1、2、3、4、5、6株系为阳性转基因植株,并进一步对鉴定为阳性的转基因植株提取总蛋白液进行稻瘟病菌体外的抗性鉴定、田间自然发病情况下的抗病性检测以及对转基因植株进行室内苗期稻瘟病菌接种性鉴定,初步研究结果表明,各阳性转基因植株的总蛋白提取液在体外对稻瘟病菌具有一定程度上的抑制作用;在田间自然发病情况下,野生型圣稻感染了稻瘟病,而相同生长条件下的各阳性转基因株系均未感病;对T1代阳性转基因株系的三叶一心期进行室内稻瘟病菌接种性鉴定,转化Rs-AFP1基因的各阳性株系中,除第10株系表现为感病外,其余均表现为抗病,转化PNRSC基因的各阳性株系中,除第2株系表现为感病外,其余均表现为抗病。由此可见,外源Rs-AFP1基因及白藜芦醇合成酶基因PNRSC的导入均可在一定程度上提高目标植物对病害的耐性及抗性,从而为水稻抗稻瘟病转基因新品种的培育提供了候选材料。水稻条纹叶枯病病毒即RSV的基因组由4个独立的单链RNA大分子组成,按照分子量大小分别命名为RNA1～RNA4。利用由pUC19改造的具有两对同尾酶的RNAi载体分别与RSV的单链RNA正向和反向连接,中间含有一段内含子,从而使正链和反链互补形成一个发夹结构,根据RNA干扰的原理,该表达载体导入植物体后如遇到RSV的侵染,将产生使RSV的单链RNA沉默的结果,从而使其无法表达而丧失致病性。研究中我们根据RSV的4个单链RNA分别设计了12对引物,利用感染病毒的水稻叶片所提取的RNA为模板,通过RT-PCR以及PCR技术克隆出5个水稻条纹叶枯病毒不同的cDNA片段,将它们分别命名为OsRSV(1-5),然后构建RNA干扰载体,利用农杆菌介导法转化黄淮区主栽品种“圣稻13”,获得了4株转OsRSV1片段的转基因植株、6株转OsRSV2片段的转基因植株、5株转OsRSV3片段的转基因植株、7株转OsRSV4片段的转基因植株、11株转OsRSV5片段的转基因植株,通过除草剂Basta涂抹以及PCR分子鉴定确定阳性转基因株系,并对鉴定为阳性的转基因株系进行田间自然发病情况下的抗病性观察。初步结果表明,野生型圣稻感染了条纹叶枯病,而相同生长条件下的各阳性转基因株系均未感病。接下来我们将对各阳性转化材料进行抗虫性、抗病性鉴定,进而筛选出抗病有效区段,为进一步培育抗条纹叶枯病的水稻新品系提供材料。综上所述,本研究利用基因工程手段解决稻瘟病、条纹叶枯病相关的水稻病害问题,并对获得的转基因阳性的黄淮稻区水稻主栽品种进一步进行抗病能力的筛选及检测,以期能培育并获得抗稻瘟病、抗条纹叶枯病能力提高的转基因水稻新品种。该方面的工作是保障我国未来食物安全、人民健康的需要,也是环境保护、能源替代的需要,更是转基因技术产业化发展的需要。因此,培育抗稻瘟病及抗条纹叶枯病的转基因水稻新品种意义重大而深远。