心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）在心脏组织中数量巨大,占细胞总数的70%。在体内除了为心肌细胞提供物理支撑外,还具有很强的增殖和代谢能力,可通过自分泌和旁分泌方式为心肌细胞提供营养。CFs具有干细胞的生物学特征,在一定条件下可以分化为多种细胞类型。在心肌受损时,部分CFs具有自发向梗死区迁移并转化为心肌样细胞的能力,有助于心肌修复,但是存在转化效率低下的问题。因此,如何将其高效转化为心肌样细胞,是目前心肌再生和心肌修复研究最受关注的热点之一。研究表明在体外用转录因子对CFs进行重编程,能够使其转化为心肌样细胞,表达心肌细胞的特异性蛋白,并具备心肌细胞特有的电生理特性。然而外源基因的导入仍存在效率低和安全性差等问题,限制了在临床上的应用。除了此方法外,近年来有众多研究显示小分子化合物能够完全替代转录因子,促进细胞的重编程,这无疑为人们实现CFs向心肌样细胞的转化提供了新的方法和思路。目前报道的小分子化合物有不同的种类,其中关键的化学物质SB431542可以通过抑制TGF-β信号通路促使成纤维细胞进行转分化。Forskolin作为腺苷酸环化酶AC激活剂可引起PKA介导的连接蛋白磷酸化,促进心肌化基因的表达。Dorsomorphin作为BMP信号通路的抑制剂,能够诱导Smad活化,并促进心肌细胞的生成。各种小分子通过作用于不同信号通路,分别参与激活不同特异性基因,这些基因活化后的转录因子继续激活下游靶基因,启动CFs向心肌样细胞分化。但在其共同作用下调控CFs最终发生分化的关键基因仍未明确,因此有必要进一步通过分析表达谱来观察哪些基因在CFs分化过程中起关键的调控作用,分析其通过什么途径调控CFs向心肌样细胞转化。阐明这些问题,将为揭示CFs向心肌细胞高效转化的机制,调动CFs的心肌修复潜能和在体利用CFs替代损伤的心肌细胞发挥功能提供实验依据和理论支撑。为了揭示CFs向心肌样细胞分化过程中的分子机制,本研究拟使用小分子化合物组合CFDSV体外诱导CFs向心肌细胞分化,观察诱导分化效率以及分化过程心肌特异性蛋白和基因的表达规律,并通过RNA-seq技术筛选CFs向心肌样细胞转化过程中发生显著变化的基因,构建目的基因过表达慢病毒载体感染CFs,观察这些基因对CFs向心肌样细胞分化的调节功能,进而筛选出能显著影响分化的关键基因。1.小分子化合物组合CFDSV有效诱导心脏成纤维细胞向心肌样细胞分化利用差速贴壁法分离培养大鼠CFs,检测其纯度并鉴定后,用小分子化合物组合CFDSV（5μmol/L CHIR99021,10μmol/L Forskolin,1μmol/L Dorsomorphin,5μmol/L SB431542和200nmol/L valproiz acid）对第3代CFs进行心肌分化体外诱导。通过检测诱导后不同时段（3d、8d、12d、16d）细胞形态学变化、心肌特异性蛋白和基因的表达变化、细胞增殖能力变化及参与分化基因的表达变化来评估其促心肌分化能力。结果显示,CFDSV诱导后的细胞体积明显缩小,胞体变圆,发出细长的突起,细胞间交织成网,细胞折光度变强;细胞增殖能力明显受到抑制;cTnT免疫荧光染色从无到有,并逐渐增强和稳定,cTnT阳性细胞数从少（0.035%）到多（42.6%）;Cx43、α-actin、Gata4、Tbx5和Mef2c等多种心肌相关蛋白均呈阳性表达,其中Cx43主要在细胞连接处表达,α-actin主要表达在细胞质,均在诱导第16d达到峰值;Gata4和Mef2c主要表达在细胞核,随诱导过程呈升高趋势,在诱导第12d达到峰值,之后下降;Tbx5在诱导3d出现,主要在细胞核分布,8d达到高峰,之后逐渐消失,并与cTnT呈现互补性表达。此外多能性基因Sox2在CFs胞质中的表达,随心肌化进程逐渐降低。由此表明,小分子化合物组合CFDSV可诱导CFs逐渐丧失多能性,定向分化为心肌样细胞,并具有较高的诱导效率。2.Tpm1是正向调控心脏成纤维细胞向心肌样细胞分化的重要基因为了明确在CFs向心肌样细胞分化过程中起重要调控作用的关键基因,提取CFDSV诱导组和对照组细胞的RNA进行转录组序列分析。根据测序结果对表达差异基因进行GO富集分析及KEGG通路分析。利用RT-PCR技术对差异显著的基因进行mRNA含量检测,进一步确定数据可靠性,并初步确定心肌分化过程的关键基因。结果显示,通过对比CFDSV诱导组与对照组的相关基因发现,在CFDSV诱导组共有2441个基因发生显著性变化,其中有1141个基因表达上调,1300个基因表达下调。Go富集和KEGG分析发现上调的基因与心脏发育、肌纤维收缩活动、肌肉组织发育关系最为密切,主要富集在P13K-Akt、细胞黏着、肥厚性心肌病等信号通路。下调的基因与生物发育过程相关,主要富集在纤维化发生、Wnt和TGF-β等信号通路。RT-PCR检测显示,Tnnt2、Actc1、Myh6、Mef2c、Pdlim3、Myh11、Tpm1、Nppa、Tpm2等心肌相关基因的表达上调,Wnt2b、Tgfbi、Sox2、Col7a1、Tgfbr3、Wnt5a、Col4a4、Fbln1等基因表达下调,这些结果也与测序结果基本一致。选择表达量改变最为显著的Tpm1和Tpm2构建过表达慢病毒感染CFs,通过观察两者对细胞增殖和凋亡的影响和RT-PCR验证发现,Tpm1能显著促进心肌相关基因的表达。为了进一步探讨Tpm1在心肌分化过程中的作用,通过慢病毒过表达和干扰技术改变CFs内Tpm1表达水平,继而观察Tpm1表达水平的改变对CFs向心肌样细胞分化的影响。结果显示,感染Tpm1过表达慢病毒后,CFs中cTnT和α-actin的表达量较空载组明显增高,Cx43的表达与空载组比较无变化。感染Tpm1干扰病毒后,虽用CFDSV进行心肌化诱导处理,但CFs中cTnT、Cx43和α-actin的表达仍受到抑制。上述结果说明Tpm1具有正向调控CFs向心肌样细胞分化的功能。3.Tpm1通过激活PI3K-Akt通路促进心脏成纤维细胞向心肌样细胞分化通过KEGG通路分析发现用CFDSV诱导分化后表达上调的基因主要富集在PI3K-Akt信号通路,为了进一步验证PI3K-Akt通路是否参与小分子化合物组合CFDSV诱导CFs向心肌的分化过程,利用western blotting对CFDSV诱导后下游通路分子Akt进行检测,结果显示:CFDSV诱导CFs心肌化后激活P13K-Akt信号途径下游Akt蛋白发生磷酸化,同时心肌特异性蛋白cTnT表达也显著上升。使用PI3K抑制剂LY294002预处理对该过程具有抑制作用,下游Akt磷酸化水平明显减少,cTnT表达上调也被明显抑制。进一步对PI3K-Akt通路在Tpm1促心肌化中的作用分析显示,Tpm1过表达后,CFs中p-Akt的水平增高,同时cTnT的表达增高。用PI3K特异抑制剂Ly294002预处理后,p-Akt和cTnT表达水平的升高均被明显抑制。说明Tpm1参与激活PI3K-Akt信号通路,通过正向调控心肌特异性基因的表达促进CFs向心肌样细胞分化。结论:小分子化合物组合CFDSV可显著促进CFs向心肌样细胞分化。CFs在向心肌分化过程中有多基因参与,其中Tpm1起正性调控作用,是决定CFs向心肌分化的关键基因。Tpm1通过PI3K-Akt途径激活心肌特异性蛋白的表达,促进CFs向心肌样细胞分化。