论文部分内容阅读
为探讨混合滋养层对牛的IVF胚胎在体外发育的影响，本试验分别对胎鼠成纤维细胞、牛卵巢颗粒细胞、牛输卵管上皮细胞的培养方法进行了研究；同时，将三种细胞进行了混合培养后，再与牛IVF胚胎共培养，从而研究不同的共培养体系对牛IVF胚胎发育的影响作用。研究结果如下：1选择怀孕10.5d～17.5d的雌鼠，按试验分组(10.5-12.5d、13.5-14.5d、15.5-17.5d)分别获取不同胎龄胎鼠，同等条件下研究胎鼠成纤维细胞的最佳分离时间；分别用不用浓度（0.025％、0.05％、0.125％和0.25％）的胰蛋白酶于室温条件下对胎鼠组织进行消化，观察不同酶浓度对分离原代MEF的影响。结果表明：用胎龄13.5-14.5d的胎鼠来培养成纤维细胞效果最好；采用0.125％胰蛋白酶消化8-11min对细胞的损伤较小，传代之后细胞的生长速度较快。2在37℃条件下，将第3代颗粒细胞采用三种不同的消化方式进行消化传代：0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA、TE(0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA)混合进行消化传代，统计不同消化方式的细胞贴壁率；相同的条件下，分别采用刮取法、组织块法及消化法对输卵管进行处理，观察比较不同的获取方法对原代细胞培养的影响。结果表明，TE组细胞在12h和24h的贴壁率均高于其他两组（P<0.05），效果最好；通过刮取法获取的输卵管上皮细胞培养效果优于组织块法和消化法。3将胎鼠成纤维细胞、牛卵巢颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞分别按照1:1的比例进行混合培养，研究混合培养细胞的贴壁率及台盼蓝染色鉴定其存活率。结果表明：GC-BOEC组在12h、24h的贴壁率及细胞活率都显著高于其他两组(P<0.05)。4将COCs经体外培养成熟后，按相同的方法进行体外受精，精卵共孵12h后随机将假定受精卵分别移入含有不同体细胞的培养体系中进行共培养（GC组、BOEC组、GC-BOEC组、对照组）。结果：各个实验组之间卵裂率无显著差异；GC-BOEC组的桑葚胚率（43.1％）显著高于其他三个试验组（P＜0.05），GC组与BOEC组之间差异不显著；GC-BOEC组的囊胚率（34.9％）显著高于GC组（30.6％）、BOEC组（27.1％）和无共培养组（3.4％）（P＜0.05），GC组与BOEC组之间差异不显著。结论：牛卵巢颗粒细胞与输卵管上皮细胞混合滋养层较之单一滋养层能更好地维持和促进牛早期胚胎的体外发育，可替代单一滋养层。