增生性瘢痕是一种严重的皮肤增生紊乱性疾病,任何影响到深层皮肤组织的损伤均有可能导致增生性瘢痕,特别是深度烧伤、创伤、外科手术等。增生性瘢痕会引起损伤部位色素改变、瘙痒、疼痛以及挛缩等,导致患者外观缺陷和身体功能障碍,在生理方面和心理方面都严重影响着病人的生活质量。目前,对于增生性瘢痕的预防和治疗方法主要有加压疗法、硅酮凝胶、激光治疗、手术治疗以及激素与抗瘢痕药物(干扰素、5-氟尿嘧啶等)注射等,但这些治疗方法都有其局限性和副作用,并没有取得令人满意的治疗效果,还需要我们继续研究探索新的治疗方法,特别是抗瘢痕药物的研发,来更好的预防治疗增生性瘢痕。增生性瘢痕是损伤皮肤的异常纤维化愈合过程,其主要病理表现为局部成纤维细胞过度增生和胶原等细胞外基质的大量沉积。成纤维细胞在生长因子TGF-β1的作用下会转化为肌成纤维细胞,它以大量表达α-SMA为特征并具有收缩特性,正常情况下可以通过收缩伤口来促进愈合并随后逐渐凋亡消失。肌成纤维细胞是促进瘢痕形成的主要细胞,在增生性瘢痕中比例可高达96%,由于愈合过程中各种调控机制的改变,其增殖加快而凋亡减少导致细胞密度明显升高,并且大量合成Collagen-I等细胞外基质以及各种生长因子,造成ECM过度沉积和组织挛缩。因此抑制瘢痕成纤维细胞的增殖并减少Collagen-I、α-SMA、CTGF等的表达是增生性瘢痕预防治疗的关键环节。虽然现在增生性瘢痕发生的具体生物学机制还未完全明确,但普遍认为TGF-β1/Smad3信号通路在其形成过程中具有重要作用。研究发现TGF-β1能够提高纤维化相关m RNA的转录,而这个过程依赖Smad3蛋白的参与。Smad3蛋白作为细胞内信号传导蛋白能够进入细胞核发挥转录调控作用,Smad3蛋白可以被TβR-I激酶磷酸化而活化为p Smad3,p Smad3与通用型Smad蛋白结合形成转录复合物进入核内从而调节基因转录。p Smad3作为活化的Smad3蛋白在细胞外基质的表达中具有关键作用,多项研究显示瘢痕成纤维细胞中Smad3蛋白的表达和磷酸化均有增加,使其细胞增殖加快和Smad3下游纤维化相关产物表达升高,细胞处于纤维化活跃状态,抑制Smad3的合成或活化可以显著降低其纤维化活动。因此,具有Smad3抑制作用的药剂在增生性瘢痕的治疗中可能具有巨大的临床价值。在实验中,约翰霍普金斯大学药学实验室通过在已知药物库中筛选具有Smad3抑制作用的药物,发现伊维菌素具有抑制人肝癌细胞(HEP3B)Smad3蛋白磷酸化的作用。伊维菌素是源于阿维菌素家族的一种半合成的大环内酯类药物,通常用于治疗寄生虫病,对人体的安全性高副作用小。近来发现伊维菌素可以用来局部治疗酒糟鼻并表现出一定的抗炎作用,但伊维菌素对增生性瘢痕的作用此前未见报道,鉴于Smad3蛋白在瘢痕发生发展中的关键作用,本研究将主要探讨伊维菌素对瘢痕成纤维细胞纤维化活动的影响,结果发现伊维菌素能够通过抑制Smad3磷酸化降低瘢痕成纤维细胞相关纤维化活动。第一部分人原代瘢痕成纤维细胞的分离、鉴定与培养目的:分离培养出人原代瘢痕成纤维细胞。方法:收集手术切除的增生性瘢痕组织并对其进行HE染色和Masson染色观察其纤维化情况,采用酶消化法分离组织中的瘢痕成纤维细胞并常规培养,显微镜下观察贴壁细胞形态,将培养的细胞通过流式细胞仪检测FSP阳性表达的细胞。结果:增生性瘢痕组织染色呈现真皮层增厚,有大量波浪状胶原束沉积。培养提取的贴壁细胞形态:胞体较大,呈多突起的纺锤形或星形。培养细胞中FSP阳性表达率为97.5%。结论:分离提取培养的细胞确为瘢痕成纤维细胞,为后续实验提供研究基础。第二部分伊维菌素对正常和瘢痕成纤维细胞Smad3和p Smad3蛋白表达的影响目的:检测不同浓度伊维菌素对正常和瘢痕成纤维细胞Smad3和p Smad3蛋白表达的影响。方法:(1)Western blotting方法检测正常和瘢痕成纤维细胞Smad3和p Smad3蛋白表达差异。(2)根据不同药物浓度,实验设计分为5组:空白对照组、0.1umol/L干预组、0.3umol/L干预组、1.0umol/L干预组、3.0umol/L干预组。待正常和瘢痕成纤维细胞生长至80%融合密度时,加入不同浓度伊维菌素干预48h,提取细胞蛋白,采用Western blotting的方法检测各组细胞中Smad3和p Smad3的蛋白表达变化,进行统计学分析。结果:(1)与正常成纤维细胞相比,瘢痕成纤维细胞中Smad3和p Smad3蛋白表达明显增多。(2)对于正常成纤维细胞,不同浓度伊维菌素干预组与对照组相比中Smad3和p Smad3蛋白表达无明显差异(p>0.05);但对于瘢痕成纤维细胞,不同浓度伊维菌素干预组较对照组p Smad3的蛋白合成均有显著降低(p<0.05),以3.0umol/L浓度组最明显,而Smad3蛋白表达无明显变化。结论:伊维菌素能够抑制瘢痕成纤维细胞中p Smad3的蛋白合成,但对Smad3蛋白的表达无明显影响,显示其抑制Smad3磷酸化的作用。第三部分伊维菌素对瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响目的:检测不同浓度伊维菌素对瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响方法:(1)伊维菌素对细胞增殖的影响。根据不同药物浓度,实验设计分为5组:空白对照组、0.1umol/L干预组、0.3umol/L干预组、1.0umol/L干预组、3.0umol/L干预组。采用CCK-8法每隔24h检测细胞的增殖情况,连续检测5天,绘制细胞增殖曲线并进行统计学分析。(2)伊维菌素对细胞凋亡的影响。根据不同药物浓度,实验设计分为3组:空白对照组、0.3umol/L干预组、3.0umol/L干预组。待细胞生长至80%融合密度时,加入药物干预48h,应用Annexin-V凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪检测细胞的凋亡状况,进行统计学分析。结果:(1)与对照组相比,不同伊维菌素浓度(0.1、0.3、1.0、3.0umol/L)干预组细胞增殖情况明显降低,在第三天时增值率下降了9、14、21、28%(p<0.05),第五天时下降了15、31、35、38%(p<0.05),均以3.0umol/L药物组下降最明显。(2)经伊维菌素干预48h后各组细胞(空白、0.3umol/L、3.0umol/L)的凋亡率为3.9%、4.3%、5.1%,差异无明显区别(p>0.05)。结论:伊维菌素可以抑制瘢痕成纤维细胞增殖,但对细胞凋亡无明显影响。第四部分伊维菌素对瘢痕成纤维细胞I型胶原、α-SMA、CTGF的m RNA和蛋白表达的影响目的:在m RNA和蛋白水平检测不同浓度伊维菌素对瘢痕成纤维细胞I型胶原、α-SMA、CTGF表达的影响。方法:根据不同药物浓度,实验设计分为5组:空白对照组、0.1umol/L干预组、0.3umol/L干预组、1.0umol/L干预组、3.0umol/L干预组。待瘢痕成纤维细胞生长至80%融合密度时,加入不同浓度药物干预48h,提取细胞总m RNA和蛋白,采用RT-PCR和Western blotting的方法分别检测各组I型胶原、α-SMA、CTGF的m RNA和蛋白表达变化,进行统计学分析。结果:与对照组相比,不同浓度伊维菌素干预组中I型胶原、α-SMA、CTGF的m RNA表达均有显著减少(p<0.05)。与m RNA表达类似,各干预组中I型胶原、α-SMA、CTGF的蛋白合成相比对照组亦明显降低(p<0.05)。在不同浓度中以3.0umol/L浓度组抑制作用最明显。结论:伊维菌素能够抑制瘢痕成纤维细胞中I型胶原、α-SMA、CTGF的m RNA和蛋白表达。