研究目的:通过筛选多酸化合物的模拟酶活性,设计合成新型多酸纳米模拟酶P₂W₁₈Fe₄/PDA,构建谷胱甘肽（GSH）和食源性致病菌O157:H7（E.coli O157:H7）的快速检测新方法,对方法进行评价,为人体健康效应相关因子和食品安全检测提供新技术和新方法。研究方法:1.利用紫外光谱和傅里叶红外光谱对多酸化合物进行表征,利用紫外光谱,通过催化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）的显色反应检测多酸化合物的模拟酶活性。改变pH、底物浓度、多酸浓度、缓冲液组成,优化多酸基模拟酶的催化条件,利用米氏方程和双倒数曲线拟合测定多酸模拟酶纳米模拟酶的米氏常数K_M,Vmax和Kcat,进行催化动力学与催化机制研究,并与辣根过氧化氢酶进行比较,筛选目标纳米模拟酶。2.利用水热法制备铁取代钨酸多酸聚多巴胺纳米模拟酶K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈/PDA(简称P₂W₁₈Fe₄/PDA),并通过紫外光谱、红外光谱、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、EDS能谱和Zeta电位对P₂W₁₈Fe₄/PDA进行表征,利用紫外光谱,通过催化底物过氧化氢和OPD的显色反应测定其模拟酶活性。改变pH、底物浓度、多酸浓度、缓冲液组成,优化多酸基模拟酶的催化条件,利用米氏方程和双倒数曲线拟合测定P₂W₁₈Fe₄/PDA的米氏常数K_M,Vmax和Kcat,进行催化动力学与催化机制研究。3.利用紫外可见光谱和荧光光谱构建基于P₂W₁₈Fe₄/PDA纳米模拟酶的GSH的荧光和紫外双模检测新方法。通过线性曲线,线性相关系数,检测限,实际样本加标回收率,相对标准偏差和干扰试验对建立的方法进行评价,考查方法的实用性。4.利用共价键在P₂W₁₈Fe₄/PDA纳米模拟酶表面偶联E.coli O157:H7多克隆抗体,形成多酸纳米模拟酶标抗体,建立食源性致病菌E.coli O157:H7的酶联检测新方法。通过线性曲线,线性相关系数,检测限,相对标准偏差,特异性试验和干扰试验对建立的方法进行评价。研究结果:1.研究发现,在筛选的多酸化合物中,H₃PW₁₂O₄₀,H₄SiW₁₂O₄₀,H₄GeW₁₂O₄₀,α-（NH₄）₆P₂W₁₈O₆₂,α-K₆P₂W₁₈O₆₂·14H₂O,Na₈H[α-PW₉O₃₄],Na₁₀[α-SiW₉O₃₄],Na₁₀[α-GeW₉O₃₄],K₈[γ-SiW₁₀O₃₆],K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈和Na₁₀H₂W₁₂O₄₂具有过氧化物酶活性。Eu₃PMo₁₂O₄₀,H₃PMo₁₂O₄₀,H₄SiMo₁₂O₄₀,α-1,2,3-K₆H[SiW₉V₃O₃₄],H₆P₂Mo₁₈O₆₂和H₅PMo₁₀V₂O₄₀具有氧化物酶活性。K₄GeW₁₂O₄₀既不具有氧化物酶活性也不具有过氧化物酶活性。首次发现Na₈H[α-PW₉O₃₄],Na₁₀[α-SiW₉O₃₄]和Na₁₀[α-GeW₉O₃₄]在碱性条件下具有过氧化物模拟酶活性。夹心结构的多酸K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈与H₂O₂和OPD的亲和力强于其它多酸过氧化物模拟酶化合物,显示出优异的过氧化物模拟酶活性,其活性与辣根过氧化物酶相近,Kcat为3.80×10^-33 S^-1。2.成功制备了铁取代钨酸多酸聚多巴胺纳米模拟酶P₂W₁₈Fe₄/PDA,与母体多酸K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈相比,具有更优异的过氧化物模拟酶活性。实验结果发现以H₂O₂为底物的P₂W₁₈Fe₄/PDA的K_M和Vmax值分别为0.51mM和6μM·min^-1。以OPD为底物的PDA-POM的K_M和Vmax值分别为0.84μM和0.6μM·min^-1。以H₂O₂为底物时,P₂W₁₈Fe₄/PDA与K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈的K_M处于相同的数量级。以OPD为底物时P₂W₁₈Fe₄/PDA的K_M值比K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈低两个数量级,聚多巴胺显著提高了K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈对底物OPD的亲和力。3.利用P₂W₁₈Fe₄/PDA纳米模拟酶的过氧化物模拟酶活性构建了GSH的比色/荧光双模检测新方法。该方法可实现维生素C,氨基酸,离子同时干扰条件下的谷胱甘肽的灵敏、特异检测,该方法对于谷胱甘肽比色检测的线性相应范围为2-8 mM,检测限为0.18 mM;荧光检测范围为15.63-250μM,检测限为4.02μM。线性相关系数均大于0.99。利用荧光方法检测SH-SY5Y细胞裂解液中谷胱甘肽含量,加标回收率在97.86%¹01.72%,相对标准偏差为1.13%⁴.39%。4.利用P₂W₁₈Fe₄/PDA纳米模拟酶的过氧化物模拟酶活性构建了E.coli O157:H7的酶联免疫检测新方法。建立的多酸纳米模拟酶酶联免疫新方法,对于大肠杆菌O157:H7检测线性范围为10³-10⁶ cfu/mL,检测限为4.2×10² cfu/mL,线性相关系数均大于0.99×10⁶ cfu/mL金黄色葡萄球菌,副伤寒沙门氏菌,假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌对E.coli O157:H7的检测无干扰。研究结论:1.多酸化合物具有过氧化物酶活性和氧化物酶活性,其酶活性与其结构组成相关。首次发现缺位-Keggin结构的多酸化合物在碱性条件下具有过氧化物模拟酶活性。夹心结构的多酸K₁₀P₂W₁₈Fe₄（H₂O）₂O₆₈在所筛选的多酸化合物中具有最高的过氧化物酶活性。2.成功制备了铁取代钨磷多酸盐聚多巴胺纳米模拟酶P₂W₁₈Fe₄/PDA,该纳米粒子尺寸形貌均一,具有过氧化物酶活性。3.构建了基于P₂W₁₈Fe₄/PDA纳米模拟酶的谷胱甘肽比色荧光双模检测方法,方法简单、快速、检测限低、线性范围宽,精密度高,并具有较好的抗干扰性和准确性。4.构建了基于P₂W₁₈Fe₄/PDA纳米模拟酶的食源性致病菌酶联免疫检测方法,实现了对大肠杆菌O157:H7的快速灵敏检测,该方法选择性高,特异性好。