【摘 要】
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目的:在本课题中,探讨了MiR-122对缺氧性心肌凋亡的影响及其可能的作用通路。为MiR-122在临床诊疗AMI时提供基础实验理论基础。方法:（1）实验分组对照组:正常培养基培养,条件设置为温度37℃,含5%CO2的培养箱中培养;缺氧组:正常培养基培养,在细胞融合度达60-70%时换用无血清培养基置于缺氧条件下（O2含量<1%）培养24小时;（2）MiR-122表达水平的检测:q RT-PCR技术
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目的:在本课题中,探讨了MiR-122对缺氧性心肌凋亡的影响及其可能的作用通路。为MiR-122在临床诊疗AMI时提供基础实验理论基础。方法:（1）实验分组对照组:正常培养基培养,条件设置为温度37℃,含5%CO2的培养箱中培养;缺氧组:正常培养基培养,在细胞融合度达60-70%时换用无血清培养基置于缺氧条件下（O2含量<1%）培养24小时;（2）MiR-122表达水平的检测:q RT-PCR技术被用来检测MiR-122表达程度。收集正常氧及缺氧培养细胞,提取各组细胞的总RNA。使用Fastking一步法反转录-荧光定量试剂盒检测MiR-122的含量;（3）Annexin V/PI双染流式细胞术衡量心肌凋亡率:购买的Annexin V-FITC/PE凋亡试剂盒被用来评估H9C2心肌细胞的凋亡率。收集正常氧及缺氧培养细胞,用试剂盒缓冲液冲洗,再于避光条件下加入染料双染色15 min后,将样品经细胞筛过滤后放入流式细胞仪检测各组细胞的凋亡发生率;（4）Western blot法定量目标蛋白的水平:收集正常氧及缺氧培养细胞。利用细胞裂解缓冲液从H9C2细胞中分离出总蛋白后,BCA法被用来对两组细胞的蛋白浓度进行准确的定量。抗-PI3K、抗-AKT、抗-p-PI3K、抗-p-AKT和抗-GAPDH以1:1000稀释于5%封闭液中。用5%封闭液溶液阻断聚偏二氟乙烯（PVDF）膜,在4℃下用初级抗体注射过夜,然后在室温黑暗中用山羊抗兔二抗注射2h。随后,将杂交膜涂上适量的ECL发光液,并放入机器中,记录蛋白质信号,利用图像软件计算条带强度;（5）统计学处理:所有数据均采用Graph Pad Prism8.0统计软件进行统计学分析。实验所获得的数据均采用均值±标准差的形式体现,实验组与对照组之间的差异性采用单因素方差进行分析计算,P<0.05被定义为组间具有统计学差异。结果:（1）QRT-PCR法定量MiR-122表达水平,结果表明缺氧状态下培养的心肌细胞相对于正常氧下培养的心肌细胞MiR-122水平明显增高（P<0.01）;（2）流式细胞术被我们用来衡量大鼠心肌细胞的凋亡比例,结果表明缺氧心肌细胞相比与对照组凋亡比例更高（P<0.01）;（3）使用蛋白印迹法检测抗PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白表达,结果示,缺氧组相比于对照组p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著下降（P<0.01）,而两组PI3K、AKT蛋白表达量无明显变化（P>0.05）。结论:（1）缺氧可使大鼠心肌细胞MiR-122表达水平增加;（2）缺氧可增加大鼠心肌细胞的凋亡比例;（3）MiR-122通过PI3K/AKT途径加重缺血缺氧诱导的H9C2心肌细胞凋亡。
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