转基因动物模型应用广泛,常用于动物育种、基因功能鉴定以及生物反应器等方面。由于家禽胚胎发育的特殊性,使得禽类转基因的发展一直落后于哺乳动物。目前制备转基因家禽的主要方法有胚胎干细胞法、原始生殖细胞法、精子载体法等,但操作复杂,技术难度大,效率低。因此,本研究采用Replication competent ALV LTR with a splice acceptor（RCAS）载体系统,该方法操作简单,效率高。RCAS是衍生自劳斯肉瘤病毒的逆转录病毒载体,具有完全复制能力。利用RCAS系统包装出带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的病毒,通过优化转导途径,制备出转基因嵌合鸡。此外,利用腺相关病毒2/9型（AAV2/9）系统制备超表达EGFP的鸡模型,将其与转基因嵌合鸡模型比较,以判断转基因效果。最后,以RCAS系统为基础分别表达两个潜在的可能具有抗新城疫病毒（NDV）的蛋白HN（Haemagglutinin-neuraminidase protein）和FAM（Family with sequence similarity 110 member）,HN为NDV包膜蛋白,FAM为本实验室鉴定的参与细胞有丝分裂的小鼠蛋白,随后对转基因嵌合鸡模型进行攻毒试验。本研究旨在为抗病毒基因的体内功能验证提供动物模型,为抗病毒转基因鸡的研究提供技术平台。具体研究内容及结果如下:1.RCASBP（A）-EGFP表达系统的构建将EGFP基因片段插入到RCASBP（A）载体特异性酶切位点Cla I,成构建了RCASBP（A）-EGFP载体,并将载体转染DF-1细胞包装病毒。采用荧光观察、Western blot方法检测到了EGFP在DF-1细胞上的高效表达。利用DF-1细胞扩增病毒,测得病毒滴度为1.275×10⁸TU/m L（Transducing units/m L）.2.EGFP转基因嵌合鸡模型的建立（1）对鸡胚日龄、病毒用量等条件进行优化,确定RCASBP（A）病毒以10⁶TU注射8日龄鸡胚卵黄囊时,鸡胚孵化率较高。（2）将RCASBP（A）-EGFP病毒以10⁶TU/枚注射8日龄鸡胚卵黄囊,通过Western blot、组织冰冻切片检测蛋白表达,发现EGFP在心、肝、肾、腺胃、小肠、气管中表达较强,脾、肺、肌胃、法氏囊等组织表达较弱,表明成功建立了EGFP转基因嵌合鸡模型。（3）将RCASBP（A）-EGFP病毒以2×10⁷TU/只,通过颈静脉注射2日龄雏鸡,成功建立了EGFP转基因嵌合鸡模型。EGFP表达在28dpipi（day post injection）时比14dpipi效果好;28 dpi时,EGFP在肝、肺、肾、肌肉、腺胃、淋巴、气管和睾丸中有所表达,其中肝与腺胃表达较强。（4）将AAV2/9-EGFP病毒以10¹¹vg/鸡（Vector genomes/鸡）,通过颈静脉注射2日龄雏鸡,成功建立了EGFP超表达鸡模型。EGFP表达在28dpipi比14 dpi效果好;28 dpipi时,主要表达在心、肝、肺、肾、大脑、肌肉、气管等组织。3.转基因嵌合鸡抗NDV的研究构建了表达HN和FAM的RCASBP（A）-HN和RCASBP（A）-FAM系统,并利用该系统构建了稳定表达HN和FAM的DF-1细胞系。两个细胞系均有一定的抗NDV增殖的作用,病毒滴度降低约10～100倍。将病毒以10⁶TU/枚注入8日龄鸡胚的卵黄囊,成功孵化了转基因嵌合鸡。Western blot检测显示,HN仅在肌肉中表达,FAM仅在肺、肌肉中有所表达;通过RT-PCR在心、肺、肾、肌肉等组织中检测到了目的基因。利用NDV强毒株F48E9对HN和FAM转基因嵌合鸡进行攻毒实验,结果显示,与对照组相比,HN和FAM转基因嵌合鸡在死亡率上并无差异,仅出现短暂延迟;部分组织病毒滴度显示,HN和FAM转基因嵌合鸡在脑、肝、肾、腺胃中病毒滴度仅有轻微降低。综上所述,利用RCAS系统制备了转EGFP嵌合鸡模型,并利用AAV2/9-EGFP制备EGFP雏鸡表达模型。通过优化转导条件,本研究确定了RCASBP（A）-EGFP病毒通过8日龄鸡胚卵黄囊注射时,EGFP表达效果最好。利用该种方法构建了表达HN和FAM的RCAS系统,体外细胞试验显示两个基因均有效抑制了病毒的增殖。制备的HN和FAM转基因嵌合鸡,攻毒试验发现二者没有明显的抗NDV作用,可能是由于两个蛋白的体内组织表达量较低或蛋白本身抗病毒效果有限所致。以上研究为鸡体内表达目的蛋白及抗病毒转基因鸡的研究提供了技术基础。