论文部分内容阅读
目的验证自行制备的温敏性壳聚糖水凝胶作为髓核细胞支架材料构建组织工程髓核的可行性。方法1.温敏性壳聚糖水凝胶的制备及生物学评价以壳聚糖、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架,观察其物理性状,并进行全身毒性、细胞毒性和组织相容性等生物学评价。2.体外构建可注射性组织工程髓核及相关检测将壳聚糖水凝胶支架与兔髓核细胞复合构建组织工程髓核。复合培养2 d,观察髓核细胞在支架中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察髓核细胞在支架上的生长情况;复合培养3周后,行组织学、免疫组织化学检测,并用RT-PCR方法检测其分泌的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达。3.可注射性组织工程髓核修复退变椎间盘的研究18只新西兰大白兔手术建立腰椎间盘退行性变模型,随机分为3组:对照组、空白组和治疗组。在手术建立椎间盘退行性变模型结束时,在治疗组椎间隙,注射温敏性壳聚糖水凝胶与髓核细胞复合物,对照组注射壳聚糖水凝胶,空白组不予任何干预。观察椎间盘手术前后高度变化;术后12周取材大体观察椎间盘组织结构;免疫组织化学检测Ⅱ型胶原含量,分光光度法测量GAG含量,观察椎间盘退行性变修复效果。结果1.制备的温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15min可发生交联反应成为固态凝胶。生物学评价证实温敏性壳聚糖水凝胶材料无全身毒性反应,具有良好的细胞相容性和组织相容性,在生物体内一定时间后可以降解。2.吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色示壳聚糖水凝胶中大多数髓核细胞存活,少数死亡,细胞存活率> 90%;扫描电镜示髓核细胞分布于网状支架中,细胞表面有分泌的ECM;HE、番红O染色及免疫组织化学染色结果显示髓核细胞具有分泌ECM的功能;RT-PCR检测示髓核细胞在壳聚糖水凝胶支架中立体培养3周后Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖基因表达水平较单纯培养高。3.术后12周治疗组测量椎间隙高度与空白组和对照组比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)。取材大体观察,空白组椎间盘髓核与纤维环不清,中央区域的髓核为纤维组织所替代,对照组的椎间盘中度退行性变,组织结构尚可分清。治疗组的的椎间盘轻度退行性变,组织结构清晰,周围未发现炎症反应,壳聚糖材料完全降解。治疗组Ⅱ型胶原、GAG含量高于空白组和对照组(P < 0.05)。结论温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好生物相容性与安全性,髓核细胞与其复合培养后可保持正常形态及分泌功能,动物实验证实温敏性壳聚糖水凝胶复合髓核细胞具有修复退变椎间盘的能力,有望成为髓核细胞载体应用于组织工程髓核。