目的：　　铜绿假单胞菌是临床上一种重要的条件致病菌，其代谢能力极强，能够通过多种信号通路感知环境信号，协调基因表达，进行运动与固着生存状态之间的转换，以更好地适应生活环境的变化。前期研究发现，suhB缺失后，泳动能力减弱，然而生物被膜形成能力显著提高，提示SuhB在细菌生存状态的转换中，可能起到了重要的调节作用。目前已知，在铜绿假单胞菌中，GacS/GacA双组分系统和胞内第二信使c-di-GMP信号途径在急慢性感染转换的调控网络中处于中心地位。此外，Gac/Rsm途径与第二信使c-di-GMP也存在一定的关系。本研究以SuhB为切入点，研究SuhB调控铜绿假单胞菌生存状态转换的分子机制。　　方法：　　1.分别用半固体培养基（含0.3％琼脂）和结晶紫染色法检测了野生型PAK、PAK△suhB和回补株的泳动能力和24 h生物被膜生成量，以确定SuhB蛋白对铜绿假单胞菌表型的影响。　　2.铜绿假单胞菌的泳动由鞭毛介导，为了比较PAK△suhB株与野生型PAK鞭毛合成相关基因fliC、fleQ和fleSR的转录差异，构建了报告质粒；同时构建这些基因与Flag标签的融合蛋白，蛋白印迹实验比较其蛋白表达差异。　　3.为了探讨SuhB对鞭毛结构和功能的影响，我们利用透射电子显微镜检测了suhB突变株的鞭毛结构变化，并统计了其生有鞭毛的细胞的比例；同时，通过对鞭毛翻转频率的分析，检测了其鞭毛功能变化。　　4.前期研究发现，suhB突变株中gacA和小RNA分子rsmY/Z表达显著上调。为了探究GacA-RsmY/Z途径对SuhB介导的泳动能力的影响，在suhB突变株中分别敲除gacA和rsmYrsmZ后检测其泳动能力变化；而rsmY/Z能够拮抗RsmA的功能，因此在PAK△suhB株中过表达RsmA后，检测了泳动能力的变化。　　5.由于cdrA表达与胞内c-di-GMP水平相关，我们把cdrA的启动子克隆到pDN19lacZΩ载体，通过测定β-半乳糖苷酶活性，比较了野生型PAK、PAK△suhB和回补株胞内第二信使c-di-GMP水平差异。　　6.在野生型和suhB突变株中过表达能水解c-di-GMP的磷酸二酯酶PA2133，降低胞内c-di-GMP水平后，检测其泳动能力和24 h生物被膜形成量的变化。　　7.细菌生成的胞外多糖能够结合平板中的刚果红染料，随着胞外多糖的增多菌落红色逐渐加深，能够较好地反映胞外多糖生成量。为了探究suhB突变株生物被膜生成能力显著提高是否是由于胞外多糖生成增多，我们用刚果红实验比较了野生型PAK、PAK△suhB和回补株的胞外多糖合成量差异。　　8.铜绿假单胞菌中，c-di-GMP的代谢有约40种酶参与。为了找出SuhB通过哪些酶影响其胞内水平，我们利用荧光定量PCR比较了野生型和suhB突变株在OD600=1时，c-di-GMP代谢相关基因的表达差异。　　9.结合荧光定量PCR结果，选择性敲除了转录水平显著上调的双鸟苷酸环化酶编码基因gcbA，并检测了suhBgcbA双突变株胞内c-di-GMP水平变化。同时检测了其泳动能力及生物被膜形成能力的变化，探讨gcbA在SuhB调控通路中的作用。　　结果：　　1. PAK△suhB株的泳动圈直径显著小于野生型菌株、生物被膜形成能力显著高于野生型。用携带suhB基因的质粒进行遗传互补后，两种表型均回复到野生型水平。　　2.报告质粒分析显示，野生型PAK和PAK△suhB菌株，fliC、fleQ和fleSR基因在转录水平基本没有差异；蛋白印迹结果显示，FleQ和 Flic两种蛋白在PAK△suhB中表达并没有降低。　　3.透射电子显微镜观察到野生型 PAK、PAK△suhB和回补株均生有结构完整的单端鞭毛，并且生有鞭毛的细胞的比例也没有显著差异，野生型和PAK△suhB菌株长有鞭毛的菌体分别占91.3%和88.5%；然而，对鞭毛的翻转频率分析显示，suhB突变株的鞭毛翻转频率较野生型显著降低，说明SuhB在功能水平，通过影响鞭毛的翻转频率对细菌泳动能力进行调节。　　4.敲除gacA或过表达RsmA后，suhB突变株的泳动能力能够部分回复，说明GacA-RsmY/Z-RsmA途径参与了SuhB介导的对细菌泳动能力的调控。　　5. suhB突变株胞内c-di-GMP的水平显著高于野生型，而suhB回补菌株则回复到了野生型水平。　　6. suhB突变株中过表达PA2133后，胞内c-di-GMP水平显著降低，泳动能力部分回复。当用激光共聚焦显微镜对生物被膜结构进行观察时，发现其生成量和厚度显著降低。　　7.刚果红实验显示，回补株菌落颜色最深，表面有皱褶，为深红色；野生型较回补株颜色淡，但较suhB突变株颜色深。　　8.荧光定量PCR结果显示，suhB突变株中PA4367、PA0861、PA5017、PA3311、PA1727及bdlA表达显著下调，而具有双鸟苷酸环化酶活性的PA4843(gcbA)表达显著上调。　　9.敲除gcbA后，suhB突变株胞内c-di-GMP水平显著降低，泳动能力部分回复，生物被膜形成能力降低。说明 SuhB通过抑制 gcbA的表达，降低胞内c-di-GMP水平，从而促进细菌泳动，同时抑制生物被膜的形成。　　结论：　　以上结果表明， c-di-GMP信号和GacA-RsmY/Z-RsmA途径参与了SuhB介导的铜绿假单胞菌生存状态调控。suhB缺失后，双鸟苷酸环化酶 GcbA表达上调，c-di-GMP合成增加，导致泳动能力降低；同时促进细菌对物体表面的可逆性黏附转换为不可逆性黏附，有利于生物被膜的形成。我们的数据还表明，SuhB能够通过 GacA-RsmY/Z-RsmA调控铜绿假单胞菌的泳动能力，并且GacA-RsmY/Z-RsmA途径和c-di-GMP信号存在交叉，但具体机制有待进一步研究。