论文部分内容阅读
牛结核病是一种主要由牛型分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患传染病，该病被世界动物卫生组织（OIE）列为B类疫病，其传播流行影响着全球畜牧业的持续发展及人类的健康。目前牛结核病临床检测的主要方法是PPD皮肤变态反应，但是PPD与环境中其它分枝杆菌存在交叉反应，导致检测的特异性降低。ESAT6/CFP10是存在于致病性分枝杆菌中的优势抗原，其能引起动物感染早期的细胞免疫，但是在BCG疫苗株与禽结核分枝杆菌株中则没有这种基因编码，由此本研究选择ESAT6/CFP10作为临床诊断牛结核病的目的抗原以提高检测的特异性。以牛结核分枝杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的基因，并克隆至pET32a(+)表达载体中，构建重组质粒，随后将其转化入BL21（DE3）中，经IPTG诱导，得到45kd大小的蛋白。Western blot证实，重组蛋白具有良好的生物活性。Ni-NTA金属离子亲和层析得到纯化的目的蛋白。利用ESAT6/CFP10与牛型提纯结核菌素（PPD-B）对50头假定健康奶牛进行临床对比检测，结果表明， ESAT6/CFP10组的阳性结果与PPD-B组的符合率为84.2%；利用ESAT6/CFP10和PPD-B作为刺激原进行IFN-γ释放试验的对比实验，结果表明，ESAT6/CFP10组的复检结果与PPD-B组的符合率为86.7%。由此可见， ESAT6/CFP10在牛结核病临床诊断中有较好的表现。为了进一步探索ESAT6/CFP10对靶细胞（巨噬细胞）活性的潜在影响，本研究制备了负载重组质粒pEGFP-N1-ESAT6/CFP10的大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383），经1ug/ml G418筛选，获得了稳定表达的巨噬细胞系。用WST-1法测定ESAT6/CFP10对巨噬细胞增殖的影响，结果表明，10ug/ml ESAT6/CFP10对NR8383的增殖虽有明显的抑制作用，但却对负载目的基因的细胞系的生长有显著促进作用；用Griess法测定ESAT6/CFP10对巨噬细胞生成NO能力的影响，结果表明，ESAT6/CFP10在一定程度上抑制了正常NR8383合成NO的能力，但在LPS激活条件下，巨噬细胞合成NO的量显著增多。由此证实，ESAT6/CFP10是牛结核分枝杆菌的重要毒力因子，至于它对巨噬细胞的凋亡是否有直接作用，有待于进一步试验。