肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy,ALD)是过氧化物酶体病中最常见的一种,以极长链脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFA)在组织细胞中沉积为主要病理特征,通常侵害患者的大脑白质、肾上腺和睾丸等组织。根据其发病年龄及主要受累部位的不同,可分为儿童脑型、青少年脑型、成人脑型、肾上腺脊髓神经病型、单纯Addison病型、以及无症状型等6种,以儿童脑型和肾上腺脊髓神经病型较为多见。ALD是一种X-连锁隐性遗传性疾病,其发病是由于ABCD1基因突变导致其所表达的蛋白结构改变和/或功能缺陷,造成患者组织细胞的VLCFA进入过氧化物酶体进行β-氧化发生障碍,使得VLCFA在血浆和组织细胞中蓄积,最终引起神经系统脱髓鞘改变和肾上腺皮质功能减退等病理变化。患者一旦发病,往往产生不可逆的神经系统症状,尤以儿童大脑型ALD的预后严重不良——发病后的平均生存时间仅为3年左右。应用基因突变分析的方法,对ALD患者及其家系成员进行检测,了解患者的突变类型和位点及家系其他成员的基因型,不仅可为ALD患者提供明确的诊断,而且可为其家系提供遗传咨询、产前诊断以及为未来的基因治疗提供依据。本研究利用分子克隆技术,从正常人外周血提取总RNA,反转录成cDNA。以cDNA为模板,进行PCR扩增,应用限制性内切酶和连接酶,将该基因的ATP结合区编码序列导入GST融合表达载体(pGEX-4T-2),构建<WP=6>ATP结合区的原核重组表达载体,并在E. coli BL21中表达。结果得到高表达的融合蛋白,经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹鉴定,证实该蛋白为ATP结合区的融合蛋白。将纯化后的融合蛋白作为免疫原,免疫家兔并制备抗ATP结合区的抗血清。本研究先后接诊了4个ALD家系,分别从cDNA和基因组DNA两条途径为4个ALD家系进行分子诊断。采用长链RT-PCR技术,从患者及其母亲外周血提取总RNA并合成cDNA,以cDNA为模板,分4个片段扩增致病基因编码区,将纯化后的PCR产物直接测序,找出基因突变的位点。同时应用限制性内切酶酶切分析、PCR产物直接测序或扩增阻滞突变系统分析方法,分析发病家系成员的基因组DNA,以证实所发现的突变。结果发现:4个ALD家系患者的ABCD1基因上均存在错义突变,其中患者1的ABCD1基因第534位密码子发生CCC→CGC改变,使脯氨酸被精氨酸取代(P534R);患者2的ABCD1基因第266位密码子发生GGG→AGG改变,使甘氨酸被精氨酸取代(G266R);患者3母亲的ABCD1上一个等位基因第617位密码子发生CGC→GGC改变,使精氨酸被甘氨酸取代(R617G),另一个等位基因未发生突变;患者4的ABCD1基因第343位密码子发生了GGC→GTC改变,使编码的甘氨酸被缬氨酸取代(G343V)。经查阅国内外文献,其中P534R和G343V突变尚未见报道。同时分析4个ALD家系相关成员的基因型,其中4个患者均为ABCD1基因突变型,他们的母亲均是与患者有相同突变的杂合子;他们的父亲均是正常基因型。需特别指出的是,患者4的大哥基因型和患者的完全相同,但其至今未出现临床症状,而患者4和其二哥均为儿童大脑型ALD。因此,此次检测可认为是患者4大哥的症状前诊断。在检出并证实ALD家系3的基因突变位点后,本研究还对该家系进行了ALD的产前分子诊断。在妇产科医师的配合下,抽取ALD携带者的羊水,<WP=7>提取羊水细胞基因组DNA,证实排除母体细胞基因组DNA的污染后,应用扩增阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法,对胎儿羊水细胞基因组DNA进行检测。结果发现:在扩增阻滞突变系统中,胎儿羊水细胞、胎儿父母、无关对照的正常引物,均扩增出185bp的条带,而羊水细胞、胎儿母亲的突变引物,均扩增出特异性条带。斑点杂交试验亦显示,只有胎儿羊水细胞及其母基因组DNA的突变型探针显色。因此,确定胎儿羊水中检出一个相同的ABCD1基因突变(R617G)。