香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans (L) Schott]是鳞毛蕨科鳞毛蕨属多年生草本植物,在我国以黑龙江省为分布中心,五大连池地区分布最为广泛。香鳞毛蕨生境极其特殊,生长在火山喷发的岩石缝隙中,对炎热和寒冷的环境都有一定的适应性,是珍稀天然民间药用植物资源。研究学者对香鳞毛蕨的研究主要集中在栽培、生理、化学成分分析、药效分析等方面,对其苯丙烷代谢途径中黄酮生物合成的分子机制的探索还较少,研究也不够深入。黄酮类化合物生物合成代谢途径中,作为第一个关键酶,CHS处于黄酮类化合物代谢合成的前期阶段,在调控黄酮类次生代谢的途径中具有非常重要的作用。CHS基因的多样性与家族基因的复杂性使得基因的表达受到组织特异性和外界环境的调控。本论文主要是以香鳞毛蕨组培苗为材料,通过查询温光诱导条件下转录组测序的结果,利用RT-PCR(?)RACE技术克隆得到香鳞毛蕨中查尔酮合成酶基因家族,通过生物信息学分析,对其基因结构、蛋白序列和理化性质的分析,进化树的构建,确定香鳞毛蕨的进化地位。通过相对荧光定量技术和紫外分光光度计法,分别检测香鳞毛蕨植株不同组织,高温低温处理和紫外条件处理下香鳞毛蕨中CHS基因表达特异性和总黄酮物质含量,分析在不同条件下基因表达与黄酮物质积累之间的关系,探究这些结构基因在香鳞毛蕨类黄酮合成途径上扮演的角色,增加分子层面的认识,从而为真正实现类黄酮生物合成基因工程在香鳞毛蕨活性物质产量品质提高上的应用提供充足的理论依据和实验材料,为最终实现香鳞毛蕨类黄酮含量新品种培育及次生代谢产物工厂化生产的目标奠定基础。本研究中得到的主要实验结果如下：1.通过RT-PCR和RACE方法,首次从香鳞毛蕨组培苗中分离得到查尔酮合成酶家族的三个基因成员,经过序列分析,三个家族成员均属于查尔酮合成酶超基因家族序列,并分别命名为DfCHS1、DfCHS2、DfCHS3。2.DfCHS1基因序列全长1710bp,其中开放阅读框长1209bp,共编码403个氨基酸(GenBank序列号为KF530802)。DfCHS1的蛋白分子式、分子量大小和等电点分别为C1965H3094N526O574S25、44.07kD和6.33,属于不稳定的亲水性蛋白；二级结构中以α螺旋和p折叠为主,为p型蛋白；三级结构预测与二级结构结果相同；通过信号肽、蛋白卷曲结构预测和跨膜结构分析表明,DfCHS1蛋白不含信号肽,属于非分泌性蛋白,没有卷曲螺旋结构的存在,不存在跨膜结构域；对其进行糖基化位点和磷酸化位点的预测显示,DfCHS1蛋白存在3个潜在的N-糖基化位点,46个潜在的O-糖基化位点,17个蛋白激酶磷酸化位点,10个丝氨酸位点,4个苏氨酸位点和3个酪氨酸位点。序列分析表明它与水蕨、问莉、云杉的同源性比较高,分别为78%、74%、72%。DfCHS2基因序列全长1695bp,其中开放阅读框长1113bp,共编码371个氨基酸(GenBank序列号为KF530813)。DfCHS1的蛋白分子式、分子量大小和等电点分别为C1806H2856N530O522S16、40.86kD和9.34,属于不稳定的亲水性蛋白：二级结构中以α螺旋和β折叠为主,为β型蛋白；三级结构预测与二级结构结果相同；通过信号肽、蛋白卷曲结构预测和跨膜结构分析表明,DfCHS2蛋白不含信号肽,属于非分泌性蛋白,没有卷曲螺旋结构的存在,不存在跨膜结构域；对其进行糖基化位点和磷酸化位点的预测显示,DfCHS2蛋白存在3个潜在的N-糖基化位点,38个潜在的O-糖基化位点,15个蛋白激酶磷酸化位点,12个丝氨酸位点,1个苏氨酸位点和2个酪氨酸位点。序列分析表明它与水蕨、问荆、银杏的同源性比较高,分别为72%、69%、69%。DfCHS3基因序列全长1341bp,其中开放阅读框长960bp,共编码320个氨基酸(GenBank序列号为KF530615)。DfCHS1的蛋白分子式、分子量大小和等电点分别为C1490H2408N428O449S20、34.14kD和8.29,属于不稳定的亲水性蛋白；二级结构中以α螺旋和β折叠为主,为β型蛋白；三级结构预测与二级结构结果相同；通过信号肽、蛋白卷曲结构预测和跨膜结构分析表明,DfCHS3蛋白不含信号肽,属于非分泌性蛋白,没有卷曲螺旋结构的存在,不存在跨膜结构域；对其进行糖基化位点和磷酸化位点的预测显示,DfCHS3蛋白存在没有潜在的N-糖基化位点,37个潜在的O-糖基化位点,12个蛋白激酶磷酸化位点,9个丝氨酸位点,2个苏氨酸位点和1个酪氨酸位点。序列分析表明它与水蕨、问荆、银杏的同源性比较高,分别为72%、68%、69%。3.DfCHS1、DfCHS2、DfCHS3基因的蛋白序列同其它代表植物共32个物种的CHS及其家族成员构建系统发生树,CHS具有明显的种属特异性,植物中的CHS基因具有共同的起源,从进化关系上看,蕨类植物与裸子植物亲缘关系较近。4.香鳞毛蕨DfCHS1、DfCHS2、DfCHS3基因在孢子体、配子体、孢子、叶和叶柄中均有表达,其表达水平有明显差异,DfCHS1在叶柄中的表达量最高,表达量是其它组织的0.7-4倍;DfCHS2在配子体中的表达量最高,而在叶柄中几乎检测不到;DfCHS3在孢子体中的表达量最高,表达量是配子体的3倍,是叶表达量的9倍。从总体上看,DfCHS1在不同组织中的表达最为广泛,其次是DfCHS2,DfCHS3且表达量低。5.香鳞毛蕨DfCHS1、DfCHS2、DfCHS3基因的表达量在低温4℃处理条件下变化趋势是一样的,都表现出先升高,在12h时表达量达到最高,达到对照组的20倍,在48h-60h达到最低,72h又升高,低温诱导处理对CHS基因家族成员的表达量影响比较复杂且差异性显著。在高温35℃处理条件下变化趋势是一样的,这说明基因家族成员之间存在这一定的相似性。表达量在0h-24h变化相对稳定,变化量不显著,当36h后,基因的表达量出现大幅升高,是对照组的35倍左右,高温诱导处理对CHS基因家族成员的表达量影响显著,这可能与有效成分的合成有很大的关系。在紫外线处理条件下变化趋势是不一样的,只有DfCHSl在紫外照射下表达量出现了升高现象,在18h表达量达到最高,是对照组的3倍；DfCHS2和DfCHS3随着处理时间的延长,都出现了表达量下降现象,这与以前的研究相反,表达量的下降可能与植物本身的生理特性有关,可也能和其它基因的相互关系有关。6.香鳞毛蕨的不同部位,CHS基因家族成员中,DfCHS1表达量与黄酮含量的相关性最为密切且呈现出正相关,DfCHS2(?))fCHS3与其没有明显的相关性。在低温4℃条件下,黄酮含量的变化随处理时间的延长呈现W型变化,与CHS基因表达量并没有呈现出相关性。在高温35℃条件下,黄酮含量与基因表达量没有呈现相关性。在紫外线条件下,随着处理时间的延长,总黄酮含量和基因的表达量都出现较为复杂的变化趋势,没有呈现规律的变化。